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實驗概要利用RACE(利用PCR技術快速擴增全長mRNA)技術構建全長cDNA文庫是傳統C庫構建技術的改進。本實驗即是利用寡核苷酸帽法，進行全長C庫的構建，從而掌握RACE技術的原理與基本操作方法。實驗原理其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子結構作為標簽，用通用引物識別并配對標簽序列，PCR擴增后克隆PCR產物，從而構建出全長并有正確閱讀框架的C庫。RACE技術最早是cDNA水平上加接頭，以擴增未知5’序列。而隨著技術的進展，目前RACE技術已發展到直接以mRNA為模板進行操作，這就保證了全長cDNA的克隆，為研究5’和3’非編碼區及啟動子提供了條件。RACE分3’RACE和5’RACE。3’RACE原理如圖1。其用帶olig(dt)和特異酶切位點的序列為3’引物；用特異序列為5’引物，經RT－PCR后，擴增出3’全長序列，利用特異酶切位點，插入載體。 5’RACE分兩種，其一為SMART（Mechanism ......閱讀全文
劉光清 劉在新 謝慶閣(中國農業科學院蘭州獸醫研究所農業部畜禽病毒學重點開放實驗室,蘭州730046)摘 要: 反向遺傳技術是一種新興的分子生物學技術, 已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。綜述反向遺傳技術研究進展,并討論該技術在口蹄疫病毒研究中的應用。關鍵詞: 反向遺傳學 反向遺傳技術 全長c
真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3’末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到
真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3'末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的
真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3’末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA
摘 要： RACE是一種快速克隆cDNA末端的方法，目前, 該方法被廣泛應用于未知堿基序列基因的克隆，尤其是SMART RACE技術更為人們所青睞。本文總結了我們實驗室用SMART RACE技術克隆基因的一些心得體會，希望對用RACE方法克隆基因的同行有些幫助。關鍵詞： RACE; RN
現代分子生物學和免疫學的進展加深了我們對許多疾病的了解，并且導致了免疫新策略的產生，免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫測定。本文盤點了與免疫學有關的分子生物學實驗技術匯總。 一、GST pull-down實驗 GST是指谷胱甘肽巰基轉移酶，GST pull-down實驗是一個行之有效的驗
近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cD
近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA
近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA
SSH是一項可以快速獲取兩個不同生物材料中差異表達基因的分子生物學技術，是快速篩選差異表達基因的有效方法，也是尋找新基因的重要手段。該技術尤其適合以genome尚不完全清晰的物種或者以特殊材料為研究對象的科研工作者。是基因芯片技術的有效補充。基本流程:通過差減文庫構建，文庫驗證和篩選（逆向斑點雜交）
cDNA文庫構建可以：（1）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；（2）篩選目的基因并直接用于表達；（3）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。實驗方法原理cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建
cDNA文庫構建 實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉
當前，人類基因組研究的重心正在由“結構”向“功能”轉移，一個以基因組功能研究為主要內容的所謂“后基因組時代”(post-genomics)，也即功能基因組(functional genomics)時代，即將到來。如何獲取基因的功能信息，即與人類重大疾病和重要生理功能相關的基因信息，就擺在了我們面前。
從RNA到電泳鑒定一、RT-PCR原理：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA 作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA 為模板，用VI 型膠原蛋白的α1 鏈的編碼序列的特異性引物進行PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR 使RNA
脊索瘤相關基因鑒定及篩查實驗，用于（1）脊索瘤分子機制（2）基因診斷（3）基因治療。實驗方法原理真核生物的mRNA 5’端有個帽子結構，3‘端有長約200 bp 的poly(A)尾巴。據此特點，可設計一種與其互補的序列oligo dT，為了把它錨定在poly（A）尾的起始端，將其設計成T12MN（M
mRNA差異顯示法 實驗方法原理 真核生物的mRNA 5’端有個帽子結構，3‘端有長約200 bp
聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以
RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不會出太大問題。 3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單
構建全長cDNA文庫分為噬菌體文庫和質粒文庫，二者大同小異。無論怎樣，應當注意如下幾個方面： 一、保證獲得數量足夠的高質量的起始RNA。構建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進行反轉錄，這比直接
近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA
近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA
生物谷： RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不會出太大問題。 3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存
SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo(dT)30 MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準第一鏈cDNA。利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到第一鏈的5‘末端時自動加上3一5個(d
SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準第一鏈cDNA。利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到第一鏈的5‘末端時自動加上3一5個(dC)殘基，退
這里介紹的方法，是用一個生物素化的引物來幫助純化第一鏈產物。這些純化技術是可以互換的。與之類似，使用這里所介紹的基于寡核苷酸-(dT) 的引物，在反轉錄的起始階段使用的基因特異性引物（如上所述）也是可以互換的。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒寡核苷酸引物cD
在分子克隆中沒有比分離缺乏相應的 mRNA 5' 末端的序列特征結構的 cDNA 克隆更易失敗的了。通常存在于 cDNA 基因文庫中的部分克隆，由于反轉錄酶未能沿全長 mRNA 模板延伸完全，合成的 cDNA 第一條鏈往往 5' 末端不完整。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂
在用 oligo (dT) 引物構建的 cDNA 文庫中，偶而發生部分 cDNA 克隆缺失了與靶 mRNA 3' 末端互補的序列。這部分序列到底是在 cDNA 合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個環節中缺失的尚不清楚。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理在用 o
科學通報，中國科學C輯:生命科學，這兩份期刊均是由中國科學院和國家自然科學基金委員會共同主辦的，我國學術期刊中的知名品牌，被國內外各主要檢索系統收錄，如國內的《中國科學論文與引文數據庫》(CSTPCD)、《中國科學引文數據庫》(CSCD)等；美國的SCI、CA、EI，英國的SA，日本的《科技文獻
無論是從一個胚胎細胞分化為不同的組織器官，或者是從正常的組織突變為腫瘤組織，都可能涉及在同一基因組背景下不同基因的差異性表達。尋找差異表達的基因就有可能揭示細胞分化的機制或者腫瘤的成因，因而也就成為一項熱門的技術。 尋找差異表達的基因有不少方法，抑制
實驗概要本實驗介紹了樣品總RNA的提取方法。完整RNA的提取和純化，是進行RNA方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的