WesternBlot，如何成功優化？
Western Blot 現在仍然是檢測和分離蛋白最常用的一種實驗方法，但是要想得到較好的結果并不容易，只有找到合適的實驗條件并進行優化，才能以更少的時間得到更多的結果，達到事半功倍的效果！下面是 R&D Systems 品牌為您推薦的免疫印跡優化步驟和實驗涉及參考數據：一抗濃度對實驗結果的影響抗體：Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog # AF992)樣本：人 HeLa 細胞 (Fig.1)A：5% 脫脂奶粉封閉，一抗濃度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脫脂奶粉，0.15 M NaClB：5% 脫脂奶粉封閉，一抗濃度：0.2 mg/mL，溶于 5% 脫脂奶粉，0.15 M NaClFig.1脫脂奶粉及 NaCl 濃度對實驗結果的影響抗體：Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)蛋白分離：人 HeLa 細胞 (Lane 1)，MCF-......閱讀全文
Western－Blot－(AP)
主要試劑1. Membrane Blocking buffer:5% Milk ? 0.05% of Tween 20 PBS2. antibody dilution buffer: PBS 0.05% of Tween20 1.0% Milk(or BSA)?3. washing buffer:?
Western－Blot－Protocol
一、提取抗原蛋白將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min,?吸取上清至新管中,?加入750μl異丙醇,?混勻,?靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min,?棄上清,?加入1ml 0.3mol/L
western－blot原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢
Western－Blot詳解
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。 本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術: 一、原理 二、分類
Western－Blot實驗（一）
大家都知道Western Blot時間周期較長，大致可以分為忙碌的第一天，和心痛的第二天，像極了愛情。人生若只如初見，何事秋風悲畫扇。經歷轉瞬即逝的新手曙光后，便進入漫長的黑夜。第一天，從最一步的配膠，到最后一步的孵育膜都極細心像極了愛情的萌芽期，需要精心的呵護。第二天經過繁瑣的洗膜，孵二抗，洗膜，
Western－Blot實驗（二）
小巧的體格，卻一應俱全，可以靈活控制多種應用程序，包括化學發光，熒光，DNA/蛋白膠。可以滿足對實驗室各種樣品成像的要求。是目前市面上唯一的一款既可進行Cy3, Cy5, Cy2 多色熒光LED成像，又可在700和800nm處進行近紅外激光定量熒光western 成像系統。這達到對成像最完美
Western－Blot詳解（一）
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術:一、原理二、分類i.放射自顯影ii.底物化學
Western－Blot詳解（二）
11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、過氧化物酶標記的第二
Western－Blot詳解（三）
3.抗體T.做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。U.同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜，
Western－Blot詳解（四）
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。5.Marker的相關疑問MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，
Western－Blot詳解（五）
CCC.Western Stripping Buffer的配方解答：METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS二次發光protocol:1.stripping buffer
Western－Blot詳解（六）
GGG.我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進
Western－Blot詳解（八）
DDDD.顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，應該是高表達。每個涌道上50-70μg蛋白，開始用半干轉移，后來用濕轉14v，16h，用PVDF膜轉移。膠轉移后染色檢測，發現小分子量的基本轉移走了，可是為什么條帶老是不粗不濃呢?解答：可能跟你的一抗有關
Western－Blot操作步驟
背景： 蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術稱為Southe
western－blot試驗心得
前兩天做了一個western blot,現在把試驗中的一點小小的體會發上來，與大家交流，希望大家多多指點！1 本實驗室采用的脫脂奶粉已經存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質量還是難以保證的。所以本人的試驗結果中出現了小斑點。建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個
Western－Blot詳解－原理
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。?原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢
Western－Blot－with－Platelet－Protein
OUTLINEWestern blot is a wide used technique to identify a target protein/s for the certain antibody.PROTOCOLPrepare platelets.Lyse washed platelets (
Western－Blot實驗步驟
實驗步驟： 1.分別配制 5%濃縮膠和12%分離膠 12%分離膠10mL 5%積層膠6mL H2O 3.3mL H2O 4.20mL 30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris
Western－Blot操作步驟
背景： 蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術
Western－Blot詳解（三）
3.抗體 T.做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？ 解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。 U.同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的E
Western－Blot詳解（七）
TTT.目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％
westernblot實驗過程
Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。可按照以下步驟操作。1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)使用細胞裂解液，對貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品進行裂解。然后測定每個蛋白樣品
Western－Blot實驗關鍵
Western Blot操作步驟多，每一步的失誤都會造成全盤失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關鍵，如果抗體不好，就是神仙也沒招。其中內參抗體很重要，因為內參抗體的選擇關系到全盤實驗的考評。Actin，Tubulin，GAPDH我們都用過，Actin，Tubulin的缺點是有時候會出現復帶，比較穩
Western－Blot技術實驗流程
Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發光等
Western－Blot哪種染色好？
陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達1.5ug，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去，以便進行隨后的氨基酸分析。膠體金，靈敏度高，檢測范圍可達到pg級，但染色穩定。 生物素話靈敏度位于1.2之間，可用于任何一種膜。
Western－Blot技術實驗流程
Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。 基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或
WesternBlot操作流程
試劑配制（一）母液1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g蒸餾水 200ml溶解后，用濃鹽酸調pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl7.4 約17ml7.5 約16m7.6 約15ml8.0 約10ml1.
Western－Blot操作步驟（一）
背景：蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術稱為Southern
Western－Blot操作步驟（二）
四、轉膜以下以使用半干轉膜為例。對于轉印90kd以下的蛋白，轉膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入0.037%的SDS。在電泳結束前20min開始準備轉膜所需的東西。轉一張膜需準備6張的濾紙（長一般為8.1~8.3cm，寬度根據裁的膠大小實際測量，但膠一般會縮水，所以裁8cm就行）和1
Western－Blot，如何成功優化？
Western Blot 現在仍然是檢測和分離蛋白最常用的一種實驗方法，但是要想得到較好的結果并不容易，只有找到合適的實驗條件并進行優化，才能以更少的時間得到更多的結果，達到事半功倍的效果！下面是 R&D Systems 品牌為您推薦的免疫印跡優化步驟和實驗涉及參考數據：一抗濃度對實驗結果的