包括顯微鏡檢查、分離培養及鑒定、藥敏試驗等在內的臨床微生物的檢驗方法（檢驗程序）如何驗證？很多人對此非常困惑。由CNAS2016.5.30新鮮發布的《臨床微生物檢驗程序驗證指南》猶如一盞明燈給大家指明了具體的方向。雖然是針對認可實驗室制定的指南文件，其他實驗室亦可參考。
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顯微鏡檢查
4.3 顯微鏡檢查
顯微鏡檢查程序包括涂片制備、染色鏡檢和結果報告過程。實驗室在開展各種類
型顯微鏡檢查（如革蘭染色、抗酸染色、墨汁染色等）前應對本實驗室使用的檢驗程
序進行驗證，并由經培訓有涂片鏡檢能力的實驗室人員操作。檢查方法可包括手工染
片法和自動化染片法。所有樣品及其盛放容器均應當作有傳染性物質，并按照實驗室
生物安全要求進行操作。
4.3.1 驗證要求
顯微鏡檢查程序的驗證應包括能力驗證/實驗室間比對和實驗室內人員比對（當多
名人員從事該項目時）。如果沒有可獲得的能力驗證或室間質評，實驗室應自行組織實驗室間比對（宜與通過認可的實驗室比對）。若實驗室同時開展手工染片法和自動化染片法，應進行兩種方法的實驗室內部比對。
4.3.2 比對方案
4.3.2.1 樣品數量
每項檢查應使用至少 5 份樣品進行驗證，覆蓋全部樣品類型，無菌樣品類型包含
陰性和陽性結果。實驗室應優先使用已知結果的留樣樣品，當不可獲取時可采用模擬
樣品。
4.3.2.2 檢驗程序
按臨床標本常規方式處理,由本崗位工作人員使用實驗室檢驗程序進行涂片制備、
染色、鏡檢、判讀。
4.3.2.3 結果報告
根據實驗室程序文件規定進行結果報告，其中抗酸桿菌應根據“分級報告標準”
報告鏡檢結果。
4.3.3 可接受標準
每項檢查的比對結果符合率≥80% 。
分離培養
4.4.1 血培養
血培養檢驗程序包括從病人血液采集、運送、接收、孵育及監測的全過程。目前臨床實驗室廣泛使用全自動血培養系統。臨床微生物實驗室血培養系統性能驗證的主要目的是評估系統使用的培養基能否用于培養臨床常見微生物（包括酵母菌、厭氧菌、苛養菌等）以及儀器（自動化系統）能否及時檢測出血液中的大部分病原菌。
血培養性能驗證常用留樣驗證和血培養系統平行比對兩種方法。血培養系統平行比對用于評估驗證系統和參比系統檢出細菌能力的一致性，但需要樣本量大，臨床采樣有難度。留樣驗證的優點則在于可評估其檢測不常見病原菌的能力。實驗室可根據醫院病人數量和地區、病種特征等具體情況和兩種方法的特點選擇其中一種適宜的驗證方法，或兩種方法同時應用。
4.4.1.1 留樣驗證
4.4.1.1.1 驗證要求
驗證應覆蓋臨床常見微生物,需氧成人/兒童血培養瓶驗證菌株應包括需氧/兼性厭氧革蘭陽性菌、需氧/兼性厭氧革蘭陰性菌、苛養菌
（如：流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌等）和真菌，厭氧血培養瓶驗證菌株應包括兼性厭氧革蘭陽性菌、兼性厭氧革蘭陰性菌、專性厭氧菌，其他特殊用途血培養瓶參照廠家要求選擇合適類型菌株進行驗證。每種類型至少１株，總體不少于
15 株。應盡可能使用真實患者的臨床分離菌株
（性能驗證用臨床留樣菌株宜經質譜或 DNA 序列分析確認）。對于特殊、苛養菌可使用標準菌株或質控菌株。某些特殊菌株需要在培養瓶中加入無菌、未使用抗生素的廠家推薦血液標本，如不加可能不生長，如流感嗜血桿菌。
4.4.1.1.2 驗證方案
模擬臨床血流感染患者的細菌含量，用留樣菌株進行一系列稀釋，接種細菌的最
終濃度為 5-30CFU/瓶。若苛養菌需添加適量的新鮮無菌血液（成人瓶 5-10ml，兒童瓶1-3ml）后置于血培養系統上進行培養、檢測。
4.4.1.1.3 可接受標準
如果在廠家說明書規定時間內檢測出所有菌株則該方法通過驗證。 3 天時間應足以
檢測出至少
95%的臨床相關細菌， 須具備苛養菌、真菌、厭氧菌等的檢出能力。
若未能檢出應使用相同菌株進行重復試驗來驗證。若仍不能檢測，實驗室和/或制造商應在臨床使用該系統前采取糾正措施。如果血培養儀升級，原系統和新系統的差別不大，培養瓶也沒有改變，那么由供應商技術代表核查儀器性能即可，無需再次驗證。功能核查將對孵育系統和光學系統以及軟件是否按照制造商規定運行進行評價。
4.4.1.2 血培養檢測系統比對
4.4.1.2.1 驗證要求
因血培養檢測系統比對要求較高，并非強制要求執行。同一廠家由同一系統控制采集
數據的多個血培養模塊不需進行比對。
檢測系統比對允許根據患者情況和實驗室條件來評價新系統的性能，通常比對所
需臨床標本數量應≥100 例。
4.4.1.2.2 驗證方案
同一病人按照同樣的采血方法采集血液標本，接種驗證血培養瓶和參考血培養瓶
中，分別放入各自的培養系統上進行培養、檢測。
4.4.1.2.3 可接受標準
與參考方法相比，新培養系統檢測符合率至少為 95%。如果未能滿足性能要求,則
該實驗不能通過驗證或者制造商和/或使用者須采取正確的糾正措施并再次進行驗證。
4.4.2 一般培養（非血液標本）
一般培養包括各類標本（痰液、尿液、糞便、分泌物、組織等）的細菌（含厭氧菌、
結核分枝桿菌）、真菌、支原體等的培養。培養程序包括標本處理、接種、培養基選擇和適宜培養條件(溫度、氣體等)。實驗室在開展各種類型標本微生物培養檢驗前應針對培養目的對本實驗室使用的檢驗程序進行驗證。如果沒有可獲得的能力驗證或室間質評，實驗室可采用培養基驗證方法對培養程序進行驗證。使用質控菌株或留樣菌株模擬標本進行培養，驗證該培養程序是否滿足檢出性能要求。
4.4.2.1 驗證要求
每項檢查每種樣品類型至少 1 份標本。
培養基根據其用途主要分為兩種：選擇性培養基和非選擇性培養基。選擇性培養基包含能夠抑制某些微生物生長的抗生素或化學試劑，非選擇性培養基則不含抑制微生物生長的物質，能夠促進大多數微生物的生長。無論商品化培養基還是自配培養基，都需要在使用前對培養基性能進行驗證，驗證菌株可選擇質控菌株或臨床菌株。
對于某些苛養細菌專用培養基，實驗室必須確定該培養基能保證對應苛養細菌的生長。如：厭氧菌、百日咳博德特菌、彎曲菌、螺桿菌、軍團菌、淋病奈瑟菌、以及其他需要特殊生長條件的細菌。而對于一些非選擇性培養基，如血平板和巧克力平板需保證其能支持大部分細菌的生長。
4.4.2.2 驗證方案
標準菌株、能力驗證/室間質評活動使用的菌株、從臨床病人標本分離的具有穩定表型的菌株均可用做驗證菌株，實驗室對其生化特征及鑒定結果應做好相關記錄。
4.4.2.2.1 直接接種法
按照實驗室細菌分離培養 SOP 直接接種菌株至培養基上，觀察細菌生長情況。如果使用直接接種，應謹慎操作。接種菌量過多或者過少都將掩蓋培養基的促進或抑制生長的特性。如果在使用直接接種法時出現驗證不合格，則改用標準化菌懸液進行驗證。
4.4.2.2.2 標準化菌懸液法
不同實驗室之間可進行標準化菌懸液驗證比對。較高濃度的菌懸液能夠較好測試選擇性培養基抑制特定微生物生長的能力。較低濃度的菌懸液則能夠驗證非選擇性培養基充分支持細菌生長的能力。
第一步：菌懸液的準備
（1）直接菌落法：使用培養 18 到 24 個小時的菌落，在 0.85%無菌生理鹽水中制成菌懸液，使其濁度達 0.5 麥氏濁度。
（2）生長法：從 24h 培養物中接種 3 到 5 個菌落至無菌肉湯以此制備懸浮液。孵育數小時使其濁度達 0.5 麥氏濁度。
第二步：接種
（1）驗證非選擇性培養基
用無菌肉湯或者生理鹽水將 0.5 麥氏單位菌懸液進行 1:100 稀釋，每個測試平板接種 10μl（0.01ml）懸浮液，均勻涂布。如果菌落過密，則可將菌液稀釋 1000 倍后再接種。
（2）驗證選擇性培養基
用無菌肉湯或者生理鹽水將 0.5 麥氏單位菌懸液進行 1:10 稀釋，每個測試平板接種 10μl（0.01ml）懸浮液。如果菌落過密，則可將菌液稀釋 100 倍后再接種。
（3）驗證培養管
用 10μL（0.01mL）未稀釋的 0.5 麥氏濁度懸浮液進行接種。
培養溫度、氣體條件和培養時間執行實驗室 SOP 文件規定。
4.4.2.3 可接受標準
4.4.2.3.1 在選擇性培養基上驗證菌株長勢良好、菌落大小與預期相符、菌落形態典
型，并且能夠抑制特定微生物的生長，可判定性能符合要求，驗證合格。
4.4.2.3.2 在非選擇性培養基上驗證菌株長勢良好、 菌落大小與預期相符、菌落形態典
型，血培養基上的溶血類型符合，可判定非選擇性培養基驗證合格。
4.4.3 活菌計數
臨床微生物實驗室需對中段尿、肺泡支氣管灌洗液等標本進行活菌計數。活菌計
數定量培養除驗證對病原菌的分離能力外，還需對定量接種環進行驗證。定量接種環
不如微量加樣器準確，但仍不失為半定量培養或者稀釋的一種很好的方法，在允許 20%誤差存在時可以使用定量接種環。
4.4.3.1 驗證要求
定量接種環使用前應進行驗證（使用微量加樣器只需計量檢定），一次性定量接種環
每批次應抽樣驗證。
4.4.3.2 驗證方案
可以采用鉆頭法和浸染法兩種方法，鉆頭法適用于重復使用金屬環，浸染法適用于
重復使用金屬環和一次性接種環。
浸染法較易于實施，方法如下：
第一步：配制Evans blue染液（EBD）。用蒸餾水稀釋Evans blue染液為1:500、1:1000、1:2000、1:4000。
第二步：用1ul環取10環EBD原液至10ml蒸餾水中；10ul環取10環EBD原液至100ml蒸餾水中，或至10ml蒸餾水中后再稀釋10倍。
第三步：用722分光光度計600nm波長比色，重復四次。
第四步：計算
1ul環和10ul環分別配置溶液的吸光度應與1:1000EBD稀釋液相符。以1:1000稀釋
液的吸光度為比對測定值，計算接種環定量配制溶液吸光度與比對測定值的偏差。
偏差=檢測測定值-比對測定值/檢測測定值×100%。
4.4.3.3 可接受標準
允許范圍：平均偏差不超過 20%。
微生物鑒定試驗
4.5 微生物鑒定試驗
4.5.1 微生物鑒定系統
包括傳統生化鑒定系統、質譜鑒定系統、分子生物學鑒定系統等。本指南主要適
用于商業化配套的傳統生化鑒定系統，質譜和分子鑒定系統的驗證可參考執行，但還
需滿足該技術的專項要求。
4.5.1.1 驗證要求
按優先順序依次選擇標準菌株、質控菌株或其它已知菌株，試驗應覆蓋實驗室使用的全部卡片種類和/或方法一些大型醫院，其患病人群更復雜、微生物種類更多，這類醫院應對更多的菌株進行評估。對于特定地區和機構,
考慮到特殊標本不易獲取以及病人等因素，驗證菌株的選擇可適當調整。
4.5.1.2 驗證方案
菌株種類的選擇應參照廠商說明書，覆蓋革蘭陽性和革蘭陰性非苛養菌、苛養菌、厭氧菌、念珠菌、隱球菌等。包括臨床留樣菌株和標準/質控菌株。每種類型應至少
1株，總體不少于 20
株。按廠家說明書或實驗室檢測程序規定對驗證菌株進行檢測，一般要求鑒定至種水平。對于特殊類型的微生物（如棒狀桿菌、厭氧菌，芽孢桿菌），可將鑒定到屬的水平作為可以接受的性能標準。
4.5.1.3 可接受標準
標準/質控菌株符合率應為 100%，臨床菌株的符合率應在 90％以上。若未能滿足要求,則該檢測系統不能通過驗證或者制造商和/或使用者須采取措施。修正后的檢測系統應再次進行驗證。
4.5.2 血清學鑒定試驗
血清學鑒定試驗包括沙門菌/志賀菌/致病大腸桿菌/弧菌等的血清學分型。
4.5.2.1 驗證要求
沙門菌至少包括傷寒沙門菌/甲型副傷寒沙門菌/乙型副傷寒沙門菌/丙型副傷寒沙門菌；志賀菌包括福氏志賀菌、宋內志賀菌、痢疾志賀菌和鮑氏志賀菌四種；致病大腸桿菌/弧菌等根據當地衛生行政管理和實驗室情況進行選擇。優先選擇標準菌株和質控菌株，也可使用實驗室確認過的留樣臨床分離株。
4.5.2.2 驗證方案
參照實驗室操作規程進行操作。每種本地區常見血清型菌株至少 1 株。
4.5.2.3 可接受標準要求準確率 100%。
感染免疫學定性檢測
4.6 感染免疫學定性檢測
包括艱難梭菌毒素檢測、梅毒免疫學檢測（RPR/TPPA/TRUST）、肥達外斐試驗、真菌免疫學檢測（G 試驗/GM 試驗）等。
4.6.1 驗證要求
檢測至少 20 份樣品，通常陽性樣品和陰性樣品各占一半。對檢測的報告范圍進行驗證時應包括弱陽性和強陽性樣品。若弱陽性樣品不好獲取，可用適當的基質稀釋強陽性樣品獲得類似的效果。
4.6.2 驗證方案
對于未經修改的商業化試劑盒方法來說只需要驗證符合率即可，但若該項測試為高度依賴人工操作的實驗還應通過不同操作人員進行重復性/重現性的驗證。
符合率：將新檢測系統的實驗結果與參考方法（金標準）或比對方法/其他實驗室進行比較，計算待驗證方法的陰陽性符合率。
重復性/重現性應經不同批次進行驗證。評估重復性時，應在一個樣本批內對至少兩個陽性樣品、兩個陰性樣品進行重復測定。然后在不同批次重復這一過程，必要時還要更換操作人員。
4.6.3 可接受標準
符合率：與參考方法（金標準）或比對方法/其他實驗室相比其符合率應≥80％重復性/重現性:對于多人多批次檢測，結果應完全一致。
抗菌藥物敏感性試驗
4.7 抗菌藥物敏感性試驗
抗菌藥物敏感性試驗（藥敏試驗）可分為紙片法和最低抑菌濃度法（MIC 法）。
4.7.1 驗證要求
藥敏試驗方法的評估宜既保證藥敏試驗的準確性，也要確保耐藥菌株的檢出靈敏
性。例如，革蘭陽性菌藥敏卡應能檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、革蘭陰性菌藥敏卡的檢測范圍應包括超廣譜β-內酰胺酶、碳青霉烯類耐藥的檢測，細菌覆蓋多重耐藥腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌等。藥敏卡的選擇應遵循生產廠家說明書要求，不應超范圍使用。
藥敏試驗性能驗證可使用藥敏質控菌株。
4.7.2 驗證方案
參考 CLSI 細菌、真菌相關藥敏試驗操作及判斷標準，選擇藥敏質控標準菌株和藥
物。連續檢測
20－30 天，每一組藥物/細菌的抑菌圈直徑或最低抑菌濃度（MIC）超出參考范圍的頻率應不超過（≤）1/20 或
3/30；也可采用替代質控方案，即連續 5 天，每天對每一組藥物/細菌重復測定 3 次，每次單獨制備接種物， 15
個數據中超出參考范圍（抑菌圈直徑或 MIC）的結果應不超過（≤） 1 個，若失控結果為 2-3 個，則如前述，再進行 5 天，每天 3
次重復試驗，30 個數據失控結果應不超過（≤）3 個。
4.7.3 可接受標準
在新的藥敏試驗系統應用于臨床前，須滿足上述質控要求，通過后在日常檢測中
轉為室內控制要求。應對較大和重大偏差進行分析，以確定特定細菌結果是否受影響
并要求限制該細菌和特定抗菌藥物在該設備的使用。