ABSCIEX液質聯用系統在瘦肉精類物質分析中的應用

　　2011年5月18日，AB SCIEX公司與分析測試百科網聯合舉辦了“AB SCIEX液質聯用系統在瘦肉精類物質分析中的應用”網路視頻講座。本次講座是由AB SCIEX公司朱林老師和廣州市農業標準與監測中心朱銘立老師為大家作報告，主要介紹了食源性瘦肉精類物質殘留的背景及現狀，瘦肉精類物質分析的前處理方法討論，AB SCIEX質譜儀特點及優勢，AB SCIEX液質聯用分析瘦肉精類物質的應用實例等四部分內容。

　　食源性瘦肉精類物質殘留的背景及現狀

　　首先，AB SCIEX公司朱林老師向大家介紹了食源性瘦肉精類物質殘留的背景及現狀。瘦肉精是一類動物用藥的統稱。任何能夠促進瘦肉生長、抑制動物脂肪生長的物質都可以叫做“瘦肉精”，一般指β-興奮劑類，如克倫特羅、萊克多巴胺等。該類化合物熱穩定性差、極性強，適合于進行LC/MS/MS分析。鹽酸克倫特羅在肌肉特別是在內臟中會有高濃度的殘留，對人與動物的肝、腎及神經系統產生危害。歐盟最早頒布法規93/257/EWG(revision 98/536/EG)禁止其作為飼料添加劑使用，美國和加拿大也禁用，我國農業部亦發文作出同樣規定，禁止使用包括萊克多巴胺在內的任何“瘦肉精”類物質。

　　萊克多巴胺，加拿大和WHO的豬肉標準40ppb，聯合國糧農組織則是10ppb;日本和新西蘭規定本國生產不允許使用，但進口豬肉則允許有小于10ppb的殘留。FDA和WHO規定了鹽酸克倫特羅在動物體內的最高殘留為：肉0.2μg/kg、肝0.6μg/kg、腎0.6μg/kg、脂肪0.2μg/kg、奶0.05μg/kg;日本的規定是0.05μg/kg(ppb);中華人民共和國農業部第193號公告中將鹽酸克倫特羅列為違禁藥品，規定在動物體內的殘留標準為：馬、牛肌肉0.1μg/kg，肝、腎0.5μg/kg，牛奶0.05μg/kg。

　　瘦肉精類物質分析的前處理方法討論

　　隨后，朱銘立老師為大家詳細介紹了瘦肉精類物質分析的前處理方法討論。動物源性食品、動物尿樣、飼料中瘦肉精類物質分析，首先要進行酶解、提取和凈化等處理。動物組織的前處理：取2g搗碎樣品，加入8mL乙酸鈉緩沖液(pH=5.2)，再加入50μLβ鹽酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶溶液，渦旋混合，37℃下避光水浴震蕩12h。然后加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，混勻，用高氯酸調pH至1±0.3，離心取上清液，用氫氧化鈉調pH至11，加入10mL乙酸乙酯-異丙醇混合液和10mL飽和氯化鈉溶液，震蕩10min離心，收集有機相，40℃下水浴氮吹，5mL乙酸鈉緩沖液(pH=5.2)溶解，待凈化。尿樣的前處理：取5mL尿樣，加入0.5mL2mol/L的乙酸銨緩沖液(pH=5.2)，再加入40μLβ鹽酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶溶液，渦旋混合，37℃下避光水浴震蕩16h。取上清液10mL于50mL離心管，用氫氧化鈉調pH至9.8±0.2，加入10mL乙酸乙酯-異丙醇混合液，再加入1.5～2.0g氯化鈉，震蕩10min離心，收集有機相，重復提取一次，合并有機相，50℃下旋轉蒸干，5mL2mol/L的乙酸銨緩沖液(pH=5.2)溶解，待凈化。飼料樣品前處理：取飼料樣品10g，加鹽酸甲醇溶液19mL，1mL飽和醋酸鉛(沉淀蛋白)。超聲震蕩萃取30min，離心10min，取上清液待凈化。

　　鹽酸克倫特羅為弱堿性藥物，在堿性條件下(pH-pKa>2)時，鹽酸克倫特羅以分子形式存在。提取的第一步中采用高氯酸溶液酸化化基質，鹽酸克倫特羅以離子形式存在，易溶于水中，將其提取出來;在第二個步驟中，通過加入NaOH溶液堿化化基質，這時候鹽酸克倫特羅以分子形式存在，易溶于乙酸乙酯-異丙醇混合液，從而被萃取到有機相中。

　　取待凈化液過MCX柱(3mL甲醇、3mL水活化，待凈化液過柱，再依次用3mL水，3mL2%甲醇-水溶液，3mL甲醇淋洗，5mL5%氨水甲醇溶液洗脫)，洗脫液在40℃水浴中用氮氣吹，濃縮至1mL，再用0.45μm濾膜過濾，即獲得樣品溶液。上樣和淋洗，保留的溶劑體系要求pKa-pH>2，不含有高選擇性的反離子和低離子強度;洗脫，保留時的溶劑體系要求pH-pKa>2，含有高選擇性的反離子和高離子強度。

　　AB SCIEX質譜儀特點及優勢

　　接下來，朱林老師又介紹了AB SCIEX質譜儀卓越的性能特點及技術優勢。AB SCIEX質譜儀的特點是：強大的離子源，高靈敏度，抗污染能力強;高抗污染能力的接口，優異的重現性;LINAC離子碰撞室，高通量、多目標、超快速同時檢測;優異的穩定性和耐用性;獨有QTRAP技術，真正同時在線定量定性分析。總得來說，AB SCIEX串聯質譜不僅獨有QTRAP技術，性能優異，儀器穩定可靠，而且易用、易維護。

久經考驗的ZL氣簾接口技術

　　Turbo VTM大氣壓離子源有兩路加熱霧化器，使離子化更為充分，負壓使離子化氣流更符合空氣動力學。久經考驗的ZL氣簾接口無毛細管或復雜裝置，不會堵塞;無需加熱，不會引起化合物熱分解;ZL氣簾設計，抗污染能力強，靈敏度高;利于去離子族化，離子流穩定，重復性好。ZLLINACTM高壓碰撞室能夠分析更低含量雜質，而且分析結果更加可靠。QTRAP同時具備串聯四極桿和線性離子肼結構，可在線實時切換，輕松實現在線定量定性分析。

　　相關產品：4000 Qtrap四極桿-線性阱復合型質譜儀

　　AB SCIEX液質聯用分析瘦肉精類物質的應用實例

　　在AB SCIEX液質聯用分析瘦肉精類物質的常見應用實例方面，朱銘立老師先為大家列舉了克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅、馬布特羅、班布特羅、妥布特羅、馬賁特洛、賽布特羅、溴布特羅、福莫特羅、噴布特羅、氯丙那林片和特布他林等14種瘦肉精類物質的分析實例，展出了標準品溶液1ppb離子色譜圖，豬肉加標溶液離子色譜圖，某飼料樣品離子色譜圖(檢出萊克多巴胺)，洗豬槽水實際樣品色譜圖(檢出萊克多巴胺)，豬尿樣品稀釋5倍直接進樣實際樣品色譜圖等。

AB SCIEX QTRAP^? 4000系統

　　接著，朱林老師給大家舉了一個用AB SCIEX QTRAP^?4000系統分析克倫特羅的例子。0.05ppb Clenbuterol標準品連續進樣6次重現性CV值為1.4%，實際樣品Clenbuterol連續進樣6次重現性CV值小于4%。

　　最后，朱林老師講述了一件出口肉類產品瘦肉精超標爭議事件。對某省一批出口肉類中獸藥克倫特羅的檢測，結果符合進口國限量標準。貨物抵達進口國后，經該國檢測機構測試發現克倫特羅超標，導致貨物被扣，并面臨巨大的經濟損失。經教授采用QTRAP技術檢測發現，實際為克倫特羅MRM假陽性判斷。幾乎所有樣品的克倫特羅真實含量均低于限量的要求，部分樣品甚至根本未檢出。

Q&A

　　網友：瘦肉精類物質分析的時候，回收率總是很低，是什么原因?如何改善?

　　朱銘立老師：瘦肉精這類物質分析時回收率很低的話，應從幾方面去改善：一是通過倒推方法，判斷回收率低是在哪一過程中產生的，若是洗脫出了問題，要看一下洗脫溶劑的極性與量夠不夠;二是在實驗中要嚴格控制控制pH值和柱子的流速。

　　網友：分析豬尿樣品時，不凈化稀釋直接進樣，是否會對儀器造成污染?定量結果是否準確?

　　朱林老師：朱銘立老師將豬尿稀釋成5倍的樣品，然后直接上機，根據譜圖可以看到，對分析器沒有什么干擾。再一次證明了我們的儀器有非常好的抗污染能力，當然它只是一個快速篩查，能夠確定有還是沒有。要做進一步分析的話，可以先做樣品前處理，然后定量。

　　網友：目前瘦肉精的檢測，只能用LC-MS嗎?

　　朱銘立老師：對于瘦肉精的檢測，不是只能用LC-MS方法。現在有很多種方法用于檢測瘦肉精，如酶聯免疫法、液相色譜法、氣質聯用儀法。但是，酶聯免疫法常會出現假陽性或假陰性的現象，使結果出現一定的不確定性;液相色譜法靈敏度不夠，檢測比較單一的微量興奮劑，而現在興奮劑種類越來越多，無法用液相色譜去準確定量，甚至檢測不到;GC-MS樣品前處理比LC-MS要求更復雜，而且興奮劑極性大、熱穩定性差，不適合直接用GC-MS檢測，故需要對樣品進行衍生化，衍生效率的高低決定了檢測的好壞，而且它需要較長的時間，影響了實驗的效率，GC-MS的靈敏度也遠低于LC-MS，所以用LC-MS檢測興奮劑將是一種趨勢。

　　網友：前處理過程中為什么要使用酶?

　　朱銘立老師：因為β興奮劑大多有苯乙胺醇和叔丁基或異丙基連接而成的，根據苯環上取代基的不同，一般可分為苯胺基、苯酚或淀粉三種類型，對于苯酚、淀粉苯環上那個羥基是結合的位點，β興奮劑在體內代謝完，會跟羥基結合，形成一個葡萄糖醛干的代謝物，這就需要酶解游離出來，才能進行檢測。對于豬尿樣品，除了苯酚類的β興奮劑之外，其它經過體內代謝完之后，一般在豬尿里是以原形態形式存在的，所以有些標準對豬尿的檢測就沒有酶解這一步。但是，對檢測苯酚類的β興奮劑時需要酶解的。

　　網友：有些廠家的儀器在進行體內樣品分析時，可以將進樣前幾分鐘的樣品棄去來減少污染，AB SCIEX 的儀器是如何解決這個問題的?

　　朱林老師：我們儀器上有一個切換閥，可以設置一個切換時間，比如說設置前幾分鐘，樣品不進儀器，而是排到廢液里，然后再過幾分種樣品進入儀器，從而起到保護儀器的作用。

　　網友：何種情況適合使用MRM3定量這種方式?有什么優點?

　　朱林老師：這是QTRAP獨有的特點，通常情況下做實驗是用二級質譜來做定量分析MRM，有時候背景很高或干擾峰存在去不掉，優化色譜條件需要時間，更換離子對影響靈敏度，改變母離子的選擇性或改變分辨率等都不奏效的時候，使用MRM3技術可以輕松把這個背景去掉。

　　網友：請問QTRAP就是API 4000嗎?

　　朱林老師：不是。有一款型號是API 4000，還有一款是API 4000 QTRAP，這兩款是完全不同的儀器，具有不同的功能，但四極桿對于這兩款儀器具有完全的功能。

　　網友：Q0~Q2都是傳輸的作用，只有Q3才是真正的質量分析器嗎?

　　朱林老師：Q0是預四極桿，起到傳輸作用，Q1是選擇母離子用的，Q2又是一個傳輸，傳輸一些子離子碎片，Q3又是一個分析器。對于這個串聯質譜，Q1和Q3是兩個分析器，Q0和Q2都只起到傳輸作用。

　　網友：QTRAP是怎樣實現離子肼功能的，它是靠四級桿兩端的端蓋電壓嗎?

　　朱林老師：不是。這是在四極桿的基礎上有全新的硬件和軟件設計，在Q3后端加了一個金屬的裝置，它跟普通的四極桿上的電壓是不一樣的，依靠四極桿電壓是不能來實現這個功能的。

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