一．用戶需要自備的材料和儀器
Biotnt First Strand cDNA Synthesis Kit：A2010B0B03 ；
Biotnt qPCR Premix Kit： A2010A0112；
RNA 抽提：推薦使用Qiagen RNeasy Mini Kit (50) 74104，RNase-Free DNase Set (50)，79254
DNase/RNase free槍頭，PCR反應管，1.5 mL離心管
10 μL到1,000 μL可調節單通道微量移液器以及適配的槍頭
5 μL到20 μL可調節多通道微量移液器以及適配的一次性槍頭
定量qPCR儀器
384 微孔板排列（24*16）：每塊板分為四個區，不同區內可以加入不同的樣本；
二．實驗步驟：
2.1 實驗前準備
注意事項：
1. 開始實驗前請仔細閱讀產品使用手冊。注意：請確認qPCR array 與您的qPCR儀器匹配；
2. 嚴格按照QPCR標準步驟操作，采用以上推薦試劑盒進行抽提mRNA，注意去除基因組污染；避免核酸污染和非特異性擴增。
RNA 定量與質量控制
A. 使用無菌水(RNase-free)稀釋 RNA 樣本，檢測 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 應大于 1.8。
B. 使用公式A260× 40 ×稀釋倍數 = XXXXμg/mL 計算 RNA 濃度。
C. 使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性。
D. 建議：RNA 質量測定后，逆轉錄得到CDNA，建議用多個內參基因自行驗證CDNA 質量；
3. 基因組DNA污染控制
每個Array板塊上的GDC(Genomic DNA Control)反應孔專為檢測每個樣品進行qPCR反應時可能存在的基因組DNA污染而設置。如果該反應孔的CT值小于35，則表明存在可檢測到的基因組DNA污染，應采取措施予以解決。因此，必須從RNA樣品中去除基因組和其他全部殘余污染物。建議采用Qiagen 柱式抽提過程中加入DNAse去除基因組污染。
4. RNA 含量調平：實驗樣本的RNA 盡量調到同一水平；加入RNA 酶free的水，調整RNA 濃度；
預計每個樣本需要的 RNA 量和RT-PCR反應數(逆轉錄CDNA；采用逆轉錄試劑盒進行，每個樣本準備100ul的CDNA)；
2.2 PCR-Array 實驗步驟：
1． 從-20度冰箱拿出PCR Array，平衡到室溫后拆開自封袋，取出PCR Array的384板；
2． 融解并充分混勻BioTNT QPCR 染料法premix，短暫離心使管中試劑處于底部，冰上保存。（一塊384板需要使用4.4 ml premix）；
3． 去除積存在封閉反應板表面的冷凝物。小心撕去板上的密封膜。
4． 樣本加樣，進行QPCR 實驗；配制過程在冰上操作。
qPCR array 可對同一樣本中多個基因同時進行檢測，為了充分滿足實驗需要以及避免實驗操作產生的損耗，在配制qPCR反應液時需要比實際體積多出 10%。
充分混勻qPCR反應液，短暫離心。每個反應孔精確加入 20 μl 反應液。每次加樣都需要換用新的槍頭以避免交叉污染。
準備PCR 混合物：樣本1準備100ul CDNA，加入1ml PCR 水和1ml premix（采用BioTNT premix，貨號：A2010A0112），混合。
區一有96孔，樣本一的混合物每孔加入混合物20ul；
同理，樣本2的混合物加入區二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
同理，樣本3的混合物加入區二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
同理，樣本4的混合物加入區二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
5． 使用產品包裝中的新密封膜覆蓋qPCR反應板，確保密封膜粘貼平整和緊密以防止光線折射和蒸發損耗。把384板放入板式離心機，2000rpm 離心2分鐘；去除氣泡。
6． 開始qPCR反應，推薦使用下表中兩步法qPCR反應程序。當使用SYBR Green 染料監測qPCR反應時，需要在qPCR循環結束后立即進行溶解曲線分析。
【擴增條件】
以ABI 7900，7900，ViiA7(384 well block)為例，Detector設為SYBR, QUENCHER設為NONE,
95℃ 5分鐘→95℃ 5秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線分析
40個循環