BioTNT mRNA 引物篩選，引物定制或specific primers的使用說明
版本號：20100001
BioTNT qPCR Primer Assay for specific mRNA genes
目錄號：SER-PCR –編號（500T）;
說明書 Part A
一、產品簡介：
本試劑盒是基于最可靠的SYBR? Green-based定量real-time PCR試劑盒并應用基因表達分析。
我們的實驗為基因特異性定量PCR驗證具有統一、高效和標準化特點的擴增反應條件。
每一對引物都是經過嚴格的實驗驗證的。
已經使用適當的real time PCR Mix的時候，合適的片段大小和高的擴增效率成為保證。
qRT-PCR Primer pair kits統一的擴增效率和條件為熒光定量pcr實驗中多基因表達的檢測提供了準確而靈活的解決方案。
完整的試劑盒說明書由part A 和Part B構成。Part A 主要描述了本試劑盒的使用方法和注意事項，Part B主要注明了assay 的特異情況。
二、產品特點：
本產品適用于有一定q PCR實驗經驗的客戶或者無經驗的客戶在公司的技術指導下進行。
三、保存條件：
可在常溫下運輸。常期保存請在-20℃保存，效期12個月。
警告：本產品僅供科研使用，請勿用于醫藥、臨床治療、食品及化妝品等其他用途。
安全提示：本產品中部分試劑有腐蝕性或毒性，請勿直接接觸皮膚或吞咽；操作時請穿戴實驗服、防護鏡和手套；如果接觸皮膚，應立即用洗滌劑和大量清水沖洗；誤食或其他危急情況，請及時到醫院就治；部分試劑易燃，請注意消防安全。
四、注意事項：
請在收到此試劑盒后立刻檢查試劑盒組成，BioTNT 公司只負責受理在試劑盒簽收后三個工作日內的試劑缺失報告；
五、試劑盒組成：
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試 劑 |
說 明 |
T |
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qPCR上游引物 |
10× |
1ml （500T） |
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qPCR下游引物 |
10× |
1ml （500T） |
其他特點請參照Part B。
六、保證結果可使用的qPCR試劑：
BioTNT real time PCR Premix 貨號：A2010A0112
七、其他需要自己準備的：
1、 耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（無菌、無酶、RNase-free；貨號），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的槍頭；）；
2、 檢測的樣本CDNA；
3、 無菌無酶的 PCR 水（貨號：A2010B0X03）；
4、 離心機；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；
5、 手套，口罩。
八、預防RNase污染，應注意以下幾個方面：
1、 經常更換新手套，以防止RNase污染；
2、 使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染；
3、 RNA在Rrizol試劑中時短時間內不會被RNase降解，但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在150℃燒烤4小時，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase）；
4、 配制溶液應使用RNase-free ddH2O（貨號：A2010B0X03）
九、操作步驟：
1、 請混勻所有的試劑（15秒）；
2、 請按以下配比對每個反應配20μL的體系：
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反應液組份 |
用于熒光PCR實驗 |
||
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加量 (μL) |
終濃度 |
備注 |
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Real time PCR Premix試劑混合物 |
10 |
1× |
貨號： |
|
上游引物（10×） |
2 |
1× |
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下游引物（10×） |
2 |
1× |
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待檢DNA樣品 |
1 |
用戶提供* |
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PCR水 |
5 |
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總體積 |
20 |
*注意：如果您的cDNA模板不是使用BioTNT的cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號：A2010B0B01，A2010B0B02）進行逆轉錄合成的，請適當的調整cDNA的用量（1-6μL），調整無菌去離子水的用量，使總體積保持20μL；
*注意：如果您不使用BioTNT real time PCR Premix，請做引物濃度梯度實驗，以使實驗達到最佳效果；
*注意：建議MIX引物、標本與PCR水預混，在實驗操作中盡量避免使用移液器的最小量程，盡量減少加樣次數，以減少因加樣而導致的誤差。在操作中，應使用不含熒光物質的一次性手套(經常替換)、移液器頭(帶濾嘴自卸式)，不能用手直接觸摸PCR反應管/條/板。
*注意：如果使用其他體積的體系（5-50μl），應保證終濃度與說明書上的終濃度一致。配制反應體系時，應注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，避免產生氣泡。如果產生氣泡，請用手指將氣泡彈破，再低速離心。反應體系配制完畢后低速離心數秒，立即進行PCR擴增。
*大多數儀器建議采用20ul體系；Roche的lightcycler 和ABI 7900，stepone plus，viia7 等可以采用10ul體系；
*建議每個樣本同一個基因做雙重復或者三重復；
*設立陰性對照(即加樣品的時候用水來代替);
*建議購買BioTNT 的陽性對照( 貨號: A2010B0X10 ); 并在實驗中設立陽性對照;