鑒于COVID-2019造成的全球醫療緊急情況，加快創新步伐和開發工具來應對COVID-19的傳播至關重要。科學界正在發揮其最大的創造力，以識別和推進預防，檢測和治療的解決方案。BioXp?3200系統是使全球研究人員能夠快速合成SARS-CoV-2基因組部分的理想平臺，使它們易于用于開發疫苗，診斷和治療方法。
介紹
SARS-CoV-2是傳染病COVID-19的致病因子，COVID-19已經被認為是全球大流行疾病。SARS-CoV-2感染了成千上萬的人，奪走了全世界成千上萬人的生命[1]。SARS-CoV-2也與2002-2003年導致SARS大流行的病毒密切相關，共有約80％的基因組的相似性[2]。該病毒的主要傳播途徑是通過感染者產生的呼吸道飛沫傳播。密切接觸（<?6英尺）會增加人與人之間傳播的機會（導致在社區內可以迅速傳播），從而使該病毒具有高度傳染性。預期世界衛生組織（WHO）已宣布COVID-2019爆發為全球性公共衛生突發事件，并將其確認為全球大流行[3]。
SARS-CoV-2，類似于SARS和MERS爆發的致病因子，是長度約為30kb的單鏈正鏈RNA基因組，是RNA病毒中最多的病毒之一。冠狀病毒是一類由外套膜包裹的正鏈ＲNA
病毒，具有螺旋對稱的衣殼和外套膜結構。冠狀病毒基因組為線性單股正鏈ＲNA，5' 端為甲基化的帽狀結構，3' 端具有 poly( A)
尾巴，長度在 27 ～ 32 kb之間，是目前已知的 ＲNA 病毒中最長的 ＲNA 鏈[4-5]。SARS-CoV-2
的RNA基因組( 如圖 1 所示) 全長在 26000～32000 個堿基之間，Roujian Lu 等人根據從病人樣本分離得到的 6
組病毒基因組分析預測SARS-CoV-2至少有 12 個編碼區，包括非結構蛋白開放閱讀框( open reading frame，OＲF)
1ab、3、7、8、9、10b、13、14 和 4 個結構蛋白刺突( S) 蛋白、膜( M) 蛋白、包膜( E) 蛋白、核衣殼( N) 蛋白[6]。
SARS-CoV-2冠狀病毒顆粒 (如圖2所示) 是由一個正鏈的 ＲNA 基因組和 4 個結構蛋白 S、E、M 和 N 組成。磷酸化 N 蛋白組成病毒核衣殼，該蛋白被埋在磷脂雙層中,并被S覆蓋。M蛋白和E蛋白位于病毒包膜的S蛋白之間，構成了病毒體。
根據基因序列分析，SARS-CoV-2在遺傳學上與 SARS-CoV 和MERS-CoV的同源性分別為 79%和 50% [6]。對比SARS-CoV 和MERS-CoV 序 列，SARS-CoV-2 在非結構蛋白區域 ORF3、ORF6、7 和 8，以及結構蛋白E、N，特別是 S 蛋白的差異[7]，導致SARS-CoV-2在病毒靶向宿主和免疫反應能力上的改變，進而影響了SARS-CoV-2的毒力和傳播能力，提示對于 COVID-19臨床用藥、疫苗開發以及疾病防控策略，應在兩種冠狀病毒病的基礎上進行調整[8]。
到目前為止，尚無疫苗或治療藥物可抗擊SARS-CoV-2。生物學，特別是DNA書寫技術，可以快速研發預防劑（疫苗）和治療劑（單克隆抗體）。此外，DNA書寫可以生成用于診斷試劑盒和測定開發的質量有保證的材料。
經過合理重新設計的全長減毒基因組有助于開發針對該病毒的疫苗。另外，病毒基因組部分有助于產生抗原的抗病毒抗體，從而可以開發出可以有效治療感染患者的治療方案選擇。研發疫苗，診斷劑和治療劑的開發對于阻止這種感染的傳播是必不可少的。
在本應用筆記中，我們描述了SARS-CoV-2整個基因組的按需生產。基因組部分是使用BioXp?3200系統設計合成的。我們還描述了這些部分的連接以裝配SARS-CoV-2的全長基因組作為大腸桿菌中的細菌性人工染色體（BAC）。鑒于到目前為止已經確定了SARS-CoV-2的基因組變異體的數量（https://nextstrain.org/ncov），可能有必要將其迅速納入疫苗，治療和診斷開發流程。3200系統通過在儀器的單個通宵運行中快速合成多達32個獨立的變異基因組部分，從而加速了這一流程。
方案
在BioXp?3200系統上設計和合成SARS-CoV-2基因組部分Codex的專有設計軟件使用重復，GC流量，GC含量等參數計算序列復雜性，并合理設計了SARS-CoV-2基因組的分階段構建（約30kb）。該工具能夠手動添加添加獨特的GibsonAssembly?限制性核酸內切酶位點之后的序列（30bp）。在組裝的所有三個階段中這些特征允SARS-CoV-2基因組片段的擴增和克隆（圖3）。設計完成后，我們下了訂單，在三個工作日內收到了寡核苷酸板和專有試劑。
圖3：SARS-CoV-2基因組的分層裝配方案。
使用三個組裝階段合成基因組：在BioXp?3200系統上完成24 X?1.4 kb的第一階段組裝，然后將6 X?5.3 kb組裝成第二階段分子和?30 kb第三階段基因組。
我們將寡核苷酸板和試劑加載到BioXp?3200系統上，并啟動了自動生成的程序。BioXp?運行始于每個片段的初始構建，然后進行錯誤校正，I級分子的擴增和DNA片段的純化。BioXp?3200系統成功生成了構成整個SARS-CoV-2基因組的所有24個片段（圖4）。
圖4：使用BioXp?3200系統組裝SARS-CoV-2基因組。
（A）在BioXp?系統上合成的24Xstage I分子然后組裝成Stage II和Stage III分子。
（B）使用限制性核酸內切酶處理從BAC釋放?30kb SARS-CoV-2基因組后，使用FIGE分析分析攜帶III期分子的克隆。
（C）沿著側分子量標準克隆到BAC中的完整基因組的超螺旋DNA分析（顯示了來自單個代表性克隆的DNA分析）。
全長SARS-CoV-2基因組的層次組裝
使用GibsonAssembly?HiFi套件（Codex目錄 no. GA1100），我們克隆了第I階段的分子（?1.4 kb），并使用Sanger測序（GENEWIZ）對其進行了測序。我們使用GibsonAssembly?HiFi試劑盒將三個連續的，將第I階段分子組裝成第二II階段分子，并通過PCR擴增了產物，然后按尺寸選擇產品。使用GibsonAssembly?Ultrakit（Codex no.GA1200）將這些II階段分子進一步組裝成SARS-CoV-2的全長基因組，并使用BAC進行克隆。通過菌落PCR和場轉化凝膠電泳（FIGE），我們驗證了克隆在BAC中的整個基因組的存在。通過在適當的分子量標準下，在無溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠上4.5V/cm電泳180分鐘，通過電泳分離超螺旋DNA，進一步可視化整個克隆的基因組。
結論
BioXp?3200系統和工具使我們能夠構建SARS-CoV-2的整個基因組，從設計到最終組裝。
使用Codex專有的設計工具創建了構建SARS-CoV-2基因組所必需的三級程序集的計算機硅制圖。具體來說，我們將SARS-CoV-2的整個?30 kb基因組分為了第一階段分子（24 X?1.4 kb）二十四個部分。我們通過BioXp?套件訂購門戶訂購了具有獨特末端的這些零件。交付后，我們將試劑加載到BioXp?系統上并執行運行。經過16小時的運行，成功生成了包含SARS-CoV-2基因組的所有24dsDNA片段。我們使用GibsonAssembly?方法克隆了片段，并使用Sanger測序分離了無錯誤的克隆。
通過GibsonAssembly?方法將三個連續的I期克隆合并為II期分子（?5.3 kb），然后進行PCR擴增和大小選擇。我們使用GibsonAssembly?方法將由此獲得的六個II期分子組裝成BAC。接下來，我們使用菌落PCR篩選了96個菌落，并驗證了III期組裝基因組中II期分子的存在。然后，我們通過菌落PCR選擇了24個陽性鑒定的克隆。我們從中提取了SARS-CoV-2BAC，并使用限制酶消化從BAC中釋放了基因組。使用FIGE分析釋放的片段。我們測試的所有24個菌落均帶有?30 kb插入片段，表明SARS-CoV-2基因組的存在。我們對其中的幾個菌落進行了超級螺旋DNA分析，從而可以可視化以環形分子形式克隆到BAC中的SARS-CoV-2基因組。所有測試的菌落均經過驗證以包含全長基因組（圖4）。
總結
以前，食品法典委員會的科學家開發并部署了合成DNA技術，以通過產生菌株特異性抗原部分來應對流感的年度威脅[9]。SARS-CoV-2基因組變體的新威脅將觸發合成生物學的類似用途，以合成抗原的多種菌株特異性變體，例如刺突蛋白。BioXp?3200系統和工具是一種破壞性技術，可加快發現疫苗，診斷方法和治療方法的速度。BioXp?3200系統具有高度精確的合成dsDNA分子的能力，并能夠實現快速的設計和合成迭代循環，它將擴展研究人員針對人類，牲畜和植物的其他傳染原的發現能力。
參考文獻
[1]https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/
[2] et. al. Direct RNA sequencing and early evolution of SARSCoV-2.
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[3] https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019
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[8] 吳雅玲[1]，陳 騏[2]，王德民[3].SAＲS-Co V-2 和新型冠狀病毒肺炎:發病機制與藥物開發研究進展.福建師范大學學報 ( 自然科學版). 1000-5277( 2020) 05-0102-15
[9] Dormitzer et. al. Synthetic generation of influenza vaccine viruses for rapid response to pandemics. Sci Transl Med. 2013 May 15;5(185):185ra68. doi: 10.1126/scitranslmed.3006368