2. （可選步驟） 腫瘤抗原的制備
用于負載 DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽 （Tumor-Specific Antigens, TSA）或腫瘤相關抗原 （Tumor-αssociated Antigens, TAA），也可以是腫瘤全細胞抗原。
用
TSA 或 TAA 負載的 DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性
抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經常無法殺傷腫瘤細胞等缺陷。而用腫瘤全 細胞抗原負載 DC
可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的 TSA 或 TAA,而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊 DC
可誘導產生針對不同抗原決定簇的細 胞毒 T 淋巴細胞 （CTL） 克隆，從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。
腫瘤細胞全抗原負載
DC 的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載 DC、用凋亡腫 瘤細胞負載 DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載 DC,用腫瘤活細胞負載
DC,和將腫瘤 細胞與 DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載 DC,因該方法簡單、 快速、有效。
反復凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
2.1手術切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
2.2無菌生理鹽水洗 3 次；
2.3用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入 RPMI 1640 培養基，充分研磨；
2.4200 目無菌網過濾后收集單細胞懸液；
2.5用 RPMI 1640 培養基重懸細胞至 1-2 x 107/ml,裝入 5 ml 無菌凍存管中；
2.6將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解凍 10 min。反復 3-5 次；注：也可以-80oC/37oC 反復凍融 3-5 次。
2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm,離心 10 min；
2.8收取上清，0.22mm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；2.9-80oC 保存備用。
3. CIK 細胞的培養及鑒定
3.1 步驟 1 中獲得的 PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至 2 x 106/ml,置于培養瓶內；
3.2 37℃，5%CO2 培養箱中孵育 2 h,以使單核細胞貼壁。
3.3 收集懸浮細胞，用無血清培養液調整細胞濃度至 1-2 x 106/ml。
3.4 加入 1,000 U/ml 的重組人 IFN-γ 培養；
3.5 24 h 后加入 50ng/ml 的 CD3 單克隆抗體和 300 U/ml 的重組人 IL-2,刺激 CIK 細 胞的生長和增殖；注：此時也可同時加入 100 U/ml 的重組人 IL-1α.
3.6 每 3 天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人 IL-2 300 U/ml；
3.7在培養的第 7d,收獲 CIK 細胞，此時數量應達到 1x 109 個以上。
3.8 CIK 細胞質控：
3.8.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在 80% 以上；3.8.2 用流式細胞儀檢測細胞表面 CD3、CD8 和 CD56 等分子的表達 ,觀察CD3+CD56+細胞的比例是否明顯提高。