實驗方法原理
定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。
單點突變的原理是從常規E.coli中經純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提得到質粒。設計一對包含突變位點的引物（正、反向），和模版質粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環延伸”，(所謂的循環延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經過反復加熱褪火延伸的循環，這個反應區別于滾環擴增，不會形成多個串聯拷貝。)正反向引物的延伸產物退火后配對成為帶缺刻的開環質粒。DpnI酶切延伸產物，由于原來的模版質粒來源于常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質粒中都會出現，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉化中得以成功轉化，即可得到突變質粒的克隆。
多點突變的原理是準備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結合在同一環狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經連接成環，和單鏈模版組成雜和環，Dpn
I消化雙鏈模版，也消化雜和環中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環（mutant
ssDNA），得以轉化E.coli，形成雙鏈質粒。資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質粒是帶有較少定點突變的質粒，以引入3個定點突變為例，就是有40%
左右的轉化質粒是帶有1-2個不同定點突變的質粒（因為存在1-2個引物結合模版延伸形成單鏈環的可能）。
實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 pyrobest DNA聚合酶DpnI去離子水BSA大腸桿菌DH5a菌株
儀器、耗材 PCR儀離心管移液槍槍頭槍頭盒水浴鍋滅菌鍋培養箱
實驗步驟
一、引物設計
每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45 bp，設計的突變位點需位于引物中部。
二、反應
1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循環次數少，一般為12個循環。
2. 反應體系：
（1）10x pyrobest Buffer： 5 ul
（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul
（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul
（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul
（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul
（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul
（7）加無菌蒸餾水至50ul.
三、產物沉淀純化
1. 加1/10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20℃冰箱）5min，離心棄上清。
2. 70~75%乙醇洗鹽兩次，烘干后溶于無菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。
四、DpnI酶切
1. 酶切體系
（1）Buffer ：2 ul
（2）BSA（100╳）：0.2 ul
（3）DNA ：x ul
（4）DpnI：0.5 ul
（5）加無菌去離子水至 20 ul。
2. 30℃酶切 1~4 h。
3. 65℃水浴15min 終止反應。
五、轉化
將酶切產物轉化大腸桿菌DH5a菌株，利用抗生素篩選突變子。
六、測序驗證
展開
注意事項
1.
引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K，所以要用那些GC
buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。
2. Quick
change試劑盒分為幾種不同的類型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis
Kit標準點突變試劑盒 、QuikChange®、 XL Site-Directed Mutagenesis
Kit長模板單點突變試劑盒（>8kb）從原理上是一樣的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比較適合長片段擴增的酶和BUFFER罷了，沒什么特別的東西。
3. DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。
4. 實驗板長出來的菌有兩種可能，一種是質粒DPNI沒處理干凈長出來的（模板），一種是PCR產物轉化出來的（突變體），不過這兩種菌長得一模一樣，即使提出質粒來也是一樣（酶切和PCR都無法區分），除了測序，是分不出來的。
5.
做PCR時也最好做一個負對照（不加引物），實驗管由于PCR時有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產物，而對照管由于PCR時沒放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。如果兩者都拿去DNPI處理，就能夠證明模板已經被去除干凈。若實驗順利的話應該是：正對照長菌負對照不長菌。如果出現正負對照都長菌，那么就是DpnI沒處理好，如果正負對照都不長菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說PCR出問題了，另外一個可能就是轉化出問題了。要搞清楚是哪個問題，跑膠說明不了問題，那就做個轉化的對照，拿試劑盒的對照實驗去試感受態，馬上就能知道轉化有沒問題。
其他
一、經驗分享
1. 實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：
第一：我們吊出來的基因有點突變，相信這可能是大家經常會遇到的問題。基因好不容易吊出來，并裝進了自己的載體，卻發現有一兩個堿基跟自己的預期序列或所有的公共數據庫不匹配，然后暴昏。