DNA快速檢驗全球研究進展（二）

2.2 快速擴增檢驗

一種常用的快速擴增研究方法是選用合適的快速酶并結合快速循環程序對現有的常規試劑盒進一步優化，以達到縮短PCR擴增時間為目的。如2008年Vallone等[13]將PyroStart和SpeedSTAR兩種酶結合使用，PyroStart酶（Fermentas，Glen Burnie，MD）可實現快速擴增，SpeedSTAR酶（Takara Bio USA，Madison，WI）可提高腺苷酸化，優化各位點間的峰平衡，同時結合快速循環程序將Identifiler?擴增時間縮短為36 min；Amanda Foster[14]選擇SpeedSTARTMHS DNA聚合酶，使用Bio-Rad C1000TM擴增儀進一步提高升降溫循環的速率，同時修正每步的熱循環參數，并采用兩步代替3步的PCR方法使AmpFLSTR? Identifiler?整個擴增的時間為26 min；Bahlmann等[15]通過將PowerPlex?S5試劑與分別與3種可替代酶相結合研究，并同時使用快速循環程序將PCR的擴增縮短為1 h；James White[16]通過使用快速啟動酶Speed STARTMHS Polymerase，結合Veriti?（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）rapid thermal cycler的快速循環程序，將PowerPlex? 16 HS擴增時間縮短為1 h。另一種研究方法是將常規試劑盒與快速試劑盒相結合，或是將兩種或多種快速試劑聯合應用。如王鴻迪等[17]聯合運用AmpFLSTR Sinofile試劑盒，QIAGENFast Cycling PCR試劑盒將擴增時間縮短至60 min以內。劉琳等[18]在2013年將AmpFLSTR?Identifiler?分別與4種不同的快速PCR檢測試劑——TaKaRa，Fermentas，Invitrogen，Thermo聯合應用初次構建快速PCR擴增檢驗，并于2014年將AmpFLSTR?Identifiler Plus試劑盒與TaKaRa快速PCR檢測試劑聯合使用，從而將常規的擴增時間175 min縮短為為55 min，并再次驗證了將TyperTM19試劑盒與快速試劑結合可有效縮短PCR擴增時間。

由此可見，多種方法和途徑可以將常規PCR的擴增時間（3~5 h）不同程度的縮短，所以可以使用國產試劑結合多種商品化的試劑盒中的酶或國產的酶結合多種商品化的試劑，或是采用多種高保真、強抗抑制力的酶與多種抑制能力更強的緩沖液（均從已上市的多種試劑盒中可以獲得）相互結合，多次比較，通過微調擴增體系各成分的比例、濃度，控制添加劑、抑制劑等措施來實現不同程度的快速擴增。

3 快速設備

實現法醫DNA快速檢驗設備主要包括快速擴增設備，快速電泳分析設備。

3.1 快速擴增設備

不同擴增設備的性能，效率明顯不同。Phillip Belgrader[19]最初在1998年報道使用了比9700擴增儀具有更快升降溫速率和更好溫控性能的微型裝置充電型熱循環儀器MATCI，可在21 min內完成PCR擴增。Amanda Foster[14]在建立快速PCR的方法時，將SpeedSTARTMHS DNA聚合酶分別與Bio-Rad C1000TM，Eppendorf Mastercycler?，Finnzymes Piko?擴增儀器聯合使用，最終選用Bio-RadC1000TM擴增儀提高升降溫循環的速率，使AmpFLSTR?Identifiler?整個時間為26 min。所以盡可能選用升降溫速率快，溫控性能好的快速PCR，如Bio-Rad C1000TM，Eriti擴增儀（美國AB公司），LifePro擴增儀（杭州博日科技有限公司）等可以進一步有效縮短檢測時間。

3.2 快速電泳分析設備

目前國內實驗室普遍配置的快速電泳檢測設備有3130XL型遺傳分析儀，可在45 min完成16個樣本的同時檢測，3730型或3730XL型遺傳分析儀一次可同時完成48或96個樣本檢測，新型的3500XL型遺傳分析儀可在30 min內完成24個樣本的同時檢測，但是這些檢測設備仍然滯后于當前大批量生物物證檢驗和當代法庭科學的需求。對快速電泳分析方面的研究，2011年平原等[20]用6+1 STR試劑盒結合一種新型毛細管電泳凝膠EX-Q20進行快速電泳分析，與SinofilerTM試劑盒結合POP4膠進行比較，6+1 STR試劑盒結合新型毛細管電泳凝膠能夠得到全部分型結果且耗時較短。在快速電泳部，該新型毛細管電泳凝膠EX-Q20合成丙烯酰胺-N，N-二甲丙基烯酰胺，形成一種新型準互穿聚合物網絡，解決了傳統毛細管電泳凝膠不能兼顧分離效果與自涂敷功能的難題，同時通過局部改良和電泳參數的設置可節約成本。

4 微流控芯片技術4.1 微流控芯片技術在法醫DNA領域的發展現狀

微流控芯片技術又稱微全分析系統（miniaturized total analytical system，μTAS），是把生物、化學、醫學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。由于它在生物、化學、醫學等領域的巨大潛力，已經發展成為一個生物、化學、醫學、流體、電子、材料、機械等學科交叉的嶄新研究領域。近年來諸多學者基于微流控芯片技術的角度，對涉及快速檢驗芯片DNA提取、芯片PCR擴增、毛細管芯片電泳及集成式芯片均進行了深入的研究。

在芯片DNA提取技術方面，國內研究最多的是以二氧化硅微球為載體的固相提取，它是M48磁珠法和硅珠法提取DNA的微型化。原理如下：以二氧化硅微球、磁性微球等介質作為DNA的固相載體，首先采用高離子鹽液進行DNA吸附、有機溶劑洗脫，最后使用低離子緩沖液洗脫DNA。如2010年Duarte[21]報道了基于固相萃取原理的玻璃材質DNA提取芯片，如圖 1所示，腔室的大小1.5 cm×1.4 mm×200 μm，以確保預提取的DNA溶液量恒定；在磁場作用下整個腔室充滿磁性微球和鹽酸胍（GuHCl），整個裝置完成DNA的提取和純化。Cady等[22]也報道了基于固相萃取原理的DNA提取芯片，硅珠、sol-gel等固相載體填充于芯片中，實現了血樣等的DNA提純。陳興等[23]驗證了在多孔氧化硅芯片和普通芯片上進行DNA提取實驗，多孔氧化硅芯片提取DNA的效率更高。目前各種聚合物基底如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等由于價格低廉、加工方便已經被成功用于DNA提取系統。如2007年劉慣超等[24]制作的塑料基（PMMA）的DNA提取芯片表明:經過溶膠涂漬、在內表面制作二氧化硅層的芯片能夠實現從血液中提取DNA。王聿佶等[25]采用PDMS（聚二甲基硅氧烷）芯片，能對生物樣品中的DNA進行有效快速提取，并且在30 min內完成PCR產物的提純。國外還有報道基于pH誘導的靜電吸附DNA提取，基于UV活化的聚碳酸酯表面的DNA提取[26]，基于納米多孔過濾膜的DNA提取[27]。

芯片PCR擴增與普通PCR擴增儀相比，擴增速度有明顯優勢。普通臺式PCR擴增儀的產物擴增管升降溫度總是遠遠滯后于擴增儀腔本身的溫度，而芯片PCR則具有明顯優勢。Heidi Giese[28]報導對比普通臺式PCR儀器和微流控芯片使用SpeedSTAR試劑對樣本進行擴增，圖 2為顯示的結果，普通臺式PCR儀器擴增所用時間為145.1 min，芯片PCR的擴增所用時間為19.6 min，遠遠快于普通臺式PCR儀器。采用升降溫速率性能佳的PCR擴增儀可以明顯縮短PCR的擴增時間，同樣，提高芯片溫度控制是實現芯片PCR快速擴增的關鍵，代表性的研究有Hagan等[29]以非接觸的紅外加熱方式進行熱循環擴增，結合SpeedSTARTDNA聚合酶，僅在45 min內完成就完成了16個STR位點在微芯片上的擴增。Mathies小組[30]則以接觸式溫度控制方式實現芯片上PCR的快速擴增，同時證明了芯片PCR-CE的可行性。此外微機電技術和溫度傳感器等方面的研究也證明了可以縮短芯片PCR擴增時間。