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  • 發布時間:2022-08-30 16:14 原文鏈接: DNA測序技術的介紹

      DNA測序技術,又叫基因測序技術。

      人類基因組這部由A、T、G、C四個字母組成的卷帙浩繁的生命天書如同一座寶庫,保藏著幾千年來人們迫切想知道的秘密,DNA測序技術就好似“芝麻開門”這樣的咒語,是我們打開寶庫的金鑰匙。世界上第一個測定DNA序列的方法是由英國生化學家弗雷德里克·桑格爾發明的。自此DNA測序的速度就一直呈加速態勢。2001年人類基因組草圖耗資4.37億美元,耗時13年。到了2007年,第一個完整人類基因組序列圖譜的誕生只花費了150萬美元,3個月就搞定。2009年1月2日,美國加州太平洋生物科學公司的科學家喬納斯·考爾拉赫、斯蒂芬·特納及其研究小組在《科學》雜志上發表論文稱,他們將納米技術與芯片技術相結合,發明了一種新型測序方法,速度是現有技術的3萬倍。

      DNA sequencing technology

      Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成,每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團,使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整,使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點,但終止在不同的核苷酸上,可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段,凝膠處理后可用X -光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

      非同位素銀染測序系統操作技術

      Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統,它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速,廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到;電泳完成后經90分鐘就可讀序,這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物,減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作,也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外,也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品,對于雙鏈DNA模板有非常好的效果,具有高度的準確性,能產生均一的條帶,且背景低。

      SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物,如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP,或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。

      退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始于每個循環的退火階段。在較低溫度時,聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域,它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因,應該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。

      由于本系統采用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處:(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶,測序反應需要0.03 --2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過程,變性循環也有助于消除由于線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構,允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。

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