一、從瓊脂糖介質中純化DNA片斷 1. 用低熔點或常規熔點瓊脂糖電泳對PCR擴增片斷進行分離,該電泳安常規方法進行,緩沖液為TAE。
2. 在凝膠上,找到所需條帶,然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊脂糖凝膠 (約300毫克)
3. 如果切下的瓊脂糖為高融點的則安下面A步驟進行,如為低融點瓊脂,則安B步驟進行。
A. 將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中,加入1毫升純化用樹脂,然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘,或保溫至瓊脂完全溶解。
B. 將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中,然后將其置于70℃水浴保溫至瓊脂完全溶解,然后加入1毫升純化用樹脂到融化好的瓊脂中,將其混合20秒,但不要振動。
4. 為每一個待回收片斷準備好一個微量柱。 在每個柱的開口處,聯上一針筒,然后將這些柱與針筒的復合體與抽真空設備相連
5. 在柱-針筒復合體中加入樹脂/DNA混合物,打開真空裝置,將樹脂與DNA的混合物抽到微量柱中,斷開真空裝置與柱的連接。
6. 洗柱,加入2毫升80%的異丙醇,打開真空裝置,使這些洗柱液完全流經微量柱。
7. 繼續真空30秒以干燥樹脂,注意此干燥時間不能超過30秒。關閉真空,移去針筒。將微量柱轉移至一1.5毫升微量離心管中。10 000 g 離心2分鐘,以徹底除去殘存的異丙醇。
8. 將微量柱,再轉移至一新的1。5毫升微量離心管中,加入50微升水或TE緩沖液,靜置1分鐘(在頭30秒,DNA仍將吸附于柱上), 10 000 g 離心20秒,以洗脫DNA片斷,所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應或在-20℃保存。
二、尿素丙烯酰胺變性膠中分離DNA片斷
1. 從變形膠上切下待回收片斷,將其放如一微量離心管中。
2. 加入100微升TE緩沖液,37℃保溫30分鐘以上。
3. 將上清液吸入一新管中,加入1毫升樹脂,振蕩20秒以混勻樹脂與清液。 收起 |