<li id="omoqo"></li>
  • <noscript id="omoqo"><kbd id="omoqo"></kbd></noscript>
  • <td id="omoqo"></td>
  • <option id="omoqo"><noscript id="omoqo"></noscript></option>
  • <noscript id="omoqo"><source id="omoqo"></source></noscript>
  • 發布時間:2019-03-26 17:50 原文鏈接: DNA片段的回收實驗——樹脂回收法

    目的DNA片段的回收技術是重組DNA中的關鍵技術,回收是指從電泳介質中純化出目的片斷。

    實驗方法原理本方法特別適合于PCR片段的回收,具有純度高、操作簡潔等特點,經此方法回收的片段可有效的用于重組載體構建。通過15分鐘的純化過程,PCR產物即能被有效地從含引物二聚體、非特異性擴增引物片斷等混合物中分離出來,成為高度無鹽的、不含其他大分子成分的純化片斷。在較寬的分子量范圍內有較高的回收效率。下表為不同長度的DNA片斷,在室溫條件下,用此純化系統直接純化時,各自相應的回收率。
    實驗材料

    DNA片段

    試劑、試劑盒

    純化試劑盒異丙醇

    儀器、耗材

    離心機電泳儀電泳槽取液器微量真空裝置抽濾裝置

    實驗步驟

    一、從瓊脂糖介質中純化DNA片斷


    1.  用低熔點或常規熔點瓊脂糖電泳對PCR擴增片斷進行分離,該電泳安常規方法進行,緩沖液為TAE。


    2.  在凝膠上,找到所需條帶,然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊脂糖凝膠 (約300毫克)


    3.  如果切下的瓊脂糖為高融點的則安下面A步驟進行,如為低融點瓊脂,則安B步驟進行。


    A.  將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中,加入1毫升純化用樹脂,然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘,或保溫至瓊脂完全溶解。


    B.   將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中,然后將其置于70℃水浴保溫至瓊脂完全溶解,然后加入1毫升純化用樹脂到融化好的瓊脂中,將其混合20秒,但不要振動。


    4.  為每一個待回收片斷準備好一個微量柱。 在每個柱的開口處,聯上一針筒,然后將這些柱與針筒的復合體與抽真空設備相連


    5.  在柱-針筒復合體中加入樹脂/DNA混合物,打開真空裝置,將樹脂與DNA的混合物抽到微量柱中,斷開真空裝置與柱的連接。


    6.  洗柱,加入2毫升80%的異丙醇,打開真空裝置,使這些洗柱液完全流經微量柱。


    7.  繼續真空30秒以干燥樹脂,注意此干燥時間不能超過30秒。關閉真空,移去針筒。將微量柱轉移至一1.5毫升微量離心管中。10 000 g 離心2分鐘,以徹底除去殘存的異丙醇。


    8.   將微量柱,再轉移至一新的1。5毫升微量離心管中,加入50微升水或TE緩沖液,靜置1分鐘(在頭30秒,DNA仍將吸附于柱上), 10 000 g 離心20秒,以洗脫DNA片斷,所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應或在-20℃保存。


    二、尿素丙烯酰胺變性膠中分離DNA片斷


    1.  從變形膠上切下待回收片斷,將其放如一微量離心管中。


    2.  加入100微升TE緩沖液,37℃保溫30分鐘以上。


    3.  將上清液吸入一新管中,加入1毫升樹脂,振蕩20秒以混勻樹脂與清液。

    收起 
    注意事項

    1.  對于>3 Kb 的片斷在純化回收時,洗脫前,如先將水或TE緩沖液預熱到65-80℃,則將能有效的提高回收率。待洗脫片斷>3 Kb 時,洗脫液溫度應為65-80℃;待洗脫片斷>20 Kb 時,洗脫液溫度應達80℃。


    2.  應用TAE緩沖液,而不應用含TBE的膠,因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體或多聚體結合成難溶復合物,這種復合物使膠難熔解。


    3.  在取用純化柱樹脂中的液體前,應將樹脂充分攪勻,如樹脂中出現結晶或結塊,則應將樹脂在25-37℃,溫熱10分鐘,冷卻至30℃使用。樹脂本身不會溶。


    4.  在紫外光下觀察切割條帶時,操作要快,DNA條帶在紫外光下的暴露時間應盡量短,因UV會引起DNA變異。


    <li id="omoqo"></li>
  • <noscript id="omoqo"><kbd id="omoqo"></kbd></noscript>
  • <td id="omoqo"></td>
  • <option id="omoqo"><noscript id="omoqo"></noscript></option>
  • <noscript id="omoqo"><source id="omoqo"></source></noscript>
  • 1v3多肉多车高校生活的玩视频