2．利用末端轉移酶和α-32P-ddNTP標記DNA的3ˊ-末端
在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3ˊ-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側均被標記問題，可通過上述同樣的方法分離。
圖7-20 對雙鏈DNA進行不對稱標記的常用方法
3．利用Klenow片段和α-32P-dNTP對限制性內切酶產生的3ˊ-凹進末端進行標記
這種方法能直接制備單側末端標記的DNA，但要求待測DNA能滿足下列條件之一：①DNA兩端的一側為3ˊ-凹進末端，而另一側為平端或3ˊ-凸出末端；②兩端雖均為3ˊ-凹進末端但末端單鏈結構不同，這時可選擇不同的γ-32P-NTP來實現末端標記。這是對雙鏈DNA進行不對稱標記的常用方法，如圖7-4-4所示。
CS載體系列（CS是chemical
sequecing的縮寫）是專門為化學降解法測序進行末端標記而構建的一類克隆載體，如pSP64CS和pSP65CS。這類載體最重要的特點是，在待測DNA克隆片段的附近有兩個可被限制性酶Tth111識別的典型位點（GACN↓NNGTC，不對稱），能在克隆DNA片段兩側不同的3ˊ-凹進末端，從而方便地實現對待測DNA的單側標記。
值得特別注意的是，化學降解法對標記的待測DNA純度有較高的要求，因為鹽濃度會干擾肼對胸腺嘧啶的修飾，也會抑制A+G反應中的去嘌呤過程。因此，標記的DNA一般要經酚/氯仿抽提、70%乙醇洗滌除鹽，并用去離子水溶解而不用TE緩沖液。
㈢ 堿基特異的化學切割反應
在化學降解法中，專門用來對核苷酸作化學修飾并打開堿基環的化學試劑主要有肼（hydrazine）和二硫酸甲酯（dimethylsulphate）。
肼又叫聯氨（NH2-NH2），在堿性條件下，能作用于T/C的C4和/或C6原子位置，并同C4-C5-C6環化形成一種新的五元環。肼進一步作用釋放出吡唑啉酮環。在六氫吡啶的作用下，通過β消除反應，該堿基兩端的磷酸基團便會以磷酸分子形式從糖環上釋放出來，從而導致在這個核苷酸位置上發生DNA斷裂如果在此反應體系中加入1mol/L濃度的鹽，則肼同T的反應速率會下降，便可發生C特異的化學切割反應。因此，可以根據這一特點來區別C和C+T這2種化學切割反應。化學反應過程如圖7-21所示。
二硫酸甲酯[(CH3O)2SO2]，能使DNA堿基環中的氮原子發生甲基化反應。在DNA測序分析中所涉及的甲基化位點是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH環境中，這2種堿基的甲基化作用，都足以導致其糖苷鍵發生水解作用，而留下失去堿基的糖-磷酸骨架。再通過堿催化的β-消除反應水解無堿基糖環兩端的磷酸二酯鍵，造成DNA在此位點發生斷裂。同時，已知DNA中G的N7原子甲基化速率比A的N3原子快4~10倍，故在中性條件下水解速率G位置也比A位置要快得多（差4~6倍），這是早期Maxam-Gilbert化學降解法測序辨別DNA中G和A的基本依據。現行的化學裂解反應，都采用六氫吡啶與DNA中的甲基化堿基反應，且這種反應對甲基化的G是特異的，因此這種DNA鏈的斷裂也僅發生在G殘基位點。化學反應過程如圖7-22所示。
化學反應設有5組獨立的反應：G反應（在G 殘基上的裂解）、A+G反應（在嘌呤殘基上的裂解）、C+T反應（在嘧啶殘基上的裂解）、C反應（在C殘基上的裂解）和A＞C反應（在A和C 殘基上的裂解），A＞C反應也可以不做。
㈣ 測序圖譜的識讀
對于測序電泳圖譜的識讀，化學降解法測序要比末端終止法較為復雜，因為化學裂解反應并非是完全絕對堿基特異的。每組測序圖譜為5條或4條（A＞C反應可以不做）泳道。需要通過從C+T泳道出現的條帶中扣除C泳道的條帶而推斷T殘基的存在。類似地，A殘基的位置也要通過從A+G泳道中扣除G泳道的條帶推斷出來。同時，如果A＞C泳道中出現較強的條帶，則可確證A殘基的存在。
實際讀片時從膠片底部一個個地向頂部讀取。從下至上，一個一個地從G+A泳道和C+T泳道二個列中確定只相差一個堿基的條帶。如果在G+A泳道中出現一條帶，就看G泳道中是否有相同大小的帶，如果有即為G堿基，如果沒有則為A堿基；同樣，在C+T泳道中出現的條帶，就檢查C泳道中有無同樣大小的條帶，如果有即為C，無則為T。如果做了A＞C反應，在該列中出現較強的條帶時，可幫助A的確定。
㈤ 化學降解法測序的優點
在化學降解法與鏈終止法問世之初，利用化學降解法進行測序不僅重復性更高，而且由于只需要簡單的化學試劑和一般的實驗條件，易為普通實驗室和研究人員所掌握。而鏈終止法需要單鏈模板、特異的寡核苷酸引物和高質量的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），這在二十世紀八十年代一般的實驗室很難做到。但隨著M13mp載體的發展、DNA合成技術的進步及Sanger法測序反應的不斷完善，至今DNA測序已大都采用Sanger法進行。然而，Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析DNA甲基化修飾情況，還可以通過化學保護及修飾等干擾實驗來研究DNA的二級結構和DNA與蛋白質的相互作用，這些仍然是Maxam-Gilbert法所獨具的鮮明特點。
當然，如同雙脫氧終止法一樣，化學降解法測序的主要限制因素也是測序凝膠的分辨能力。化學測序法一般都用32P標記，所以與用32S標記作標記的末端終止法相比，它顯示的條帶較寬且有擴散現象，這限制了化學降解法在對較大DNA片段測序時的分辨能力。一般一塊電泳膠上最多能讀出200~250核苷酸序列。然而，如果按2個相反的取向分別從DNA片段的兩端進行測序，則可克服這一不足。
三、DNA序列分析的自動化
雙脫氧終止法和化學降解法自1997年提出并的逐漸完善，無疑是目前公認的二種最通用、最有效的DNA序列分析方法，Sanger、Maxam和Gilbert等人也因此分享了1979年度諾貝爾化學獎。但實際操作中都存在一些共同的問題，如放射性核素的污染，操作步驟繁瑣、效率低和速度慢等缺點，特別是結果判斷的讀片過程實在是費時又乏味的工作。隨著計算機軟件技術、儀器制造和分子生物學研究的迅速發展，DNA自動化測序技術取得了突破性進展，以其簡單（自動化）、安全（非同位素）、精確（計算機控制）和快速等優點，已成為今天DNA序列分析的主流。
DNA序列分析的自動化包括兩個方面的內容，一是指“分析反應”的自動化，更重要的一方面則是指反應產物（標記DNA片段）分析的自動化。雖然各種DNA自動測序系統差別很大，但Sanger法所采用的DNA聚合酶和雙脫氧核苷酸鏈終止的原理，亦是現今自動化測序的最佳選擇方案。即大都沿用Sanger的雙脫氧核苷酸鏈終止法原理進行測序反應，主要的差別在于非放射性標記物和反應產物（標記DNA片段）分析系統。僅舉例簡介其基本原理：
㈠ ALF全自動激光熒光DNA測序系統
ALF自動DNA測序系統，是由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）等提出和設計的。該系統采用非放射性的單一Cy5熒光素標記測序引物。沿用雙脫氧鏈終止法進行反應，分別生成4組終止于不同種類堿基、帶有Cy5熒光素標記的DNA片段。A、G、C和T四組反應物在變性凝膠上電泳，每個泳道都有一個由激光槍和探測器組成的檢測裝置，當Cy5熒光素標記的DNA條帶遷移至探測區并遇上激光時，熒光標記被激活并釋放出光信號，光信號由光探測器接收；最后電腦將收集到的信號（原始數據）進行處理，獲得樣品DNA的最終序列。
ALF系統包括電源、電泳系統、探測系統、驅控系統（計算機）和輸出設備（繪圖儀）等。與傳統的手工操作測序相比，ALF系統能直接獲取原始數據并及時加以處理。該系統在儀器硬件和驅動軟件的設計上都進行了不斷的改進，近年推出了ALF
expressTM全自動激光熒光DNA測序儀。該儀器設計獨特，可提供快速可靠的核酸測序、片段分析和突變檢測。目前廣泛應用于人類基因組計劃，在此種大規模序列測定中，該儀器起到了重要的初篩作用。
㈡ ABI型全自動DNA測序儀
ABI測序儀是由Perkin
Elmer（PE公司）推出的DNA自動化測序儀。其特點是采用ZL的4種熒光染料分別標記終止物ddNTP或引物，經Sanger測序反應后，反應產物3′端（標記終止物法）或5′端（標記引物法）帶有不同的熒光標記。一個樣品的4個測序反應產物可在同一泳道內電泳，從而降低測序泳道間遷移率差異對精確性的影響。通過電泳將各個熒光標記片段分開，同時激光檢測器同步掃描，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD（charge-coupled
device）攝影機上同步成像。電腦可在電泳過程中對儀器運行情況進行同步檢測，結果能以電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種方式輸出。
ABI測序儀包括電泳系統、激光檢測裝置、power
Macintosh型蘋果電腦、HP1600CM型彩色打印機、DNA序列分析軟件以及DNA片段大小和定量分析軟件（Gene
ScanTM）。該系統采用電腦單點控制整個DNA測序儀，包括電泳參數設置、數據收集、數據分析及結果輸出等。目前PE公司已生產出377,373,310和3700型DNA測序儀。377型全自動DNA測序儀為最新產品，具有可一次測定多個樣品（64個以上）、測序精確度高和每個樣品判讀序列長（約700bp）等優點。測序速度高達200bp/h，比373型效率提高了許多。
ABI測序儀在人類基因組測序和cDNA測序研究中應用最為廣泛。此外，亦可以使用各種輔助軟件進行DNA定量分析和大小分析，故可廣泛應用于基因突變分析（SSCP）、DNA指紋圖譜分析、基因連鎖圖譜分析及基因表達水平分析等。
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