重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在宿主細胞中進行表達，獲得相應的蛋白質的表達。
一、DNA重組
重組DNA分子的構建所需的目的基因或DNA片段可來自基因組DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；載體最常用的是質粒、噬菌體及逆轉錄病毒等；它們在限制性內切酶的作用下，可形成粘性末端或平齊末端，在DNA連接酶的作用下可連接成一個DNA重組體。
（一）目的DNA片段與載體的連接
主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結構與功能，并可達到人為改造細胞及物種個體遺傳性狀的目的。DNA克隆的一項關鍵技術就是DNA重組技術，所謂DNA重組，就是指把外源目的基因“裝進”載體過程，即DNA的重新組合。這種重新組合的DNA叫做重組體，因為是由兩種不同來源的DNA組合而成，所以又稱異源嵌合DNA。
載體在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段與之共價連接形成重組體后，才能進入合適的宿主細胞內進行復制和擴增。作為載體DNA分子，必須具有能夠在某些宿主細胞中獨立地自我復制和表達能力，這樣，外源目的基因裝入該載體后，才能在載體的帶動下一起復制，達到無性繁殖的目的；載體分子不宜過大，以便于DNA體外操作，同時載體DNA與宿主核酸應容易分開，便于提純；載體上應具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記，以區分陽性重組分子和陰性重組分子。選擇性標記包括抗藥性基因、酶基因、營養缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；載體應該具有多個限制性內切酶的單一切點，以便從中選出一種酶，使它在目的基因上沒有切點，保持目的基因的完整性。載體上的酶切位點最好是位于檢測表型的遺傳標記基因之內，這樣目的基因是否連進載體就可以通過這一表型的改變與否而得知，便于篩選重組體。
DNA重組本質上是一個酶促生物化學過程，
DNA連接酶是其中的重要角色。DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分為三步：首先ATP與T4噬菌體DNA連接酶通過ATP的磷酸與連接酶中賴氨酸的氨基形成磷酸-氨基鍵而連接產生酶-ATP復合物；然后酶-ATP復合物活化DNA鏈5’端的磷酸基團，形成磷酸-磷酸鍵；最后DNA鏈3’端的羥基活化并取代ATP，與5’端磷酸基團形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP，完成DNA之間的連接。大腸桿菌
DNA連接酶催化DNA分子連接的機理與T4噬菌體DNA連接酶基本相同，只是輔助因子是NAD +而不是ATP。
具有相同粘性末端的DNA分子比較容易連接在一起，因為相同的粘性末端容易通過堿基配對氫鍵形成一個相對穩定的結構，連接酶利用這個相對穩定的結構，行使間斷修復的功能，就可以使兩個DNA分子連接在一起。
大腸桿菌
DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，但T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即使兩端平端的雙鏈DNA分子連接起來的功能。對于這種連接反應的機理目前還不清楚，總的來說這種連接的效果比粘性末端的連接效果要低的多，可能是因為末端DNA分子無法形成類似粘性末端分子那樣的相對穩定的結構。可通過增加DNA的濃度或提高T4噬菌體DNA連接酶濃度來提高平末端的連接效率。
連接反應的一項重要參數是溫度。理論上說，連接反應的最佳溫度是37℃，此時連接酶的活性最高。但37℃時粘性末端分子形成的配對結構極不穩定，因此，人們找到了一個最適溫度，即12～16℃。此時既可最大限度地發揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結構的穩定。
進行DNA重組的方法有很多，主要有粘端連接法、平端連接法，后者包括平接法和接頭法以及粘-平端連接法。這些方法的采用主要依據外源DNA片段末端的性質，以及質粒載體與外源DNA上限制酶酶切位點的性質來做選擇。
1.粘性末端連接法：
若目的基因或DNA插入片段與適當的載體存在同源粘性末端，這將是最方便的克隆途徑。同源粘性末端包括相同一種內切酶產生的粘性末端和不同的內切酶產生的互補粘性末端。粘性末端連接（cohesive
end ligation）得到的重組質粒能夠保留結合處的限制酶切位點，因此，可以使用原切割內切酶，重新將插入片段從重組體上完整地切割下來。
在粘性末端連接時，除重組體外，還有一定數量的載體自身環化分子，這將產生較高的假陽性克隆背靜。針對這一問題，往往需要在連接前，用牛小腸堿性磷酸酶去除載體的5’磷酸以抑制質粒DNA的自身環化。另外，如果用一種限制性內切酶切割載體和外源DNA，連接時插入片段可以兩個方向插入載體中。粘性末端連接時還有一個問題是片段的多拷貝插入。欲篩選出含有正確插入方向和單拷貝插入片段的重組體，需要將重組體進行內切酶圖譜分析。適當的插入片段與載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般采用插入片段摩爾數：載體摩爾數為3：1。
2.同聚體加尾部連接法
同聚體加尾部連接法（homopolymeric tails
ligation）即當目的基因或DNA片段與載體，用限制性內切酶酶切獲得的是平齊末端；或者外源DNA片段和載體是兩個不相配的DNA片段；此時可用末端轉移酶使其中的一個DNA分子3’端上接上多聚A,另一個DNA片段3’端上接上多聚T。這樣兩個DNA分子的尾部可按A-T配對原則相聯，并由DNA聚合酶填補空隙，最后由DNA連接酶封口成重組DNA分子。
3.人工合成接頭連接法
人工合成接頭連接法（artifical linker ligation）即目的基因或DNA片段的兩端接上能夠被某一限制性內切酶識別的DNA序列（接頭），再在該酶的酶解作用下，和載體獲得相同的粘性末端，并進行連接。見圖7-9。
(二)重組DNA分子轉入宿主細胞
體外重組生成的重組子必須導入合適的宿主細胞中才能進行復制、擴增和表達。宿主細胞以大腸桿菌為代表的原核細胞和包括哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核細胞。對不同的宿主細胞應采取不同的方法導入DNA，但都以獲得盡可能多的轉化宿主細菌或細胞為前提。
1.重組DNA分子導入原核細胞
將重組的DNA分子引入細菌(原核細胞),使其在細菌體內擴增及表達的過程稱為轉化作用(transformation)。最常用的細菌是大腸桿菌，要選擇合適的菌株。細菌在生長過程中，只有某一階段的細菌才能成為轉化的接受體，這一生理狀態稱為感受態（competent）。