DCs/SHED的原代培養
Stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED)
Postnatal human dental pulp stem cells (DCs)
試劑和材料：
1.無鎂和鈣的平衡鹽溶液（A）；
2.MSC培養基：含2mmol/L 谷氨酰胺的α-MEM，添加15%胎牛血清，0.1mmol/L左旋抗壞血酸磷酸鹽，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；
3.Ⅰ型膠原酶；
4.中性蛋白酶；
5.免疫磁珠分選時所需試劑；
（1）含1%A的A
（2）與DC反應的一抗，用STRO-1（小鼠抗人MSC；IgM），CC9（小鼠抗人CD146/MUC-18；IgG2a），或3G5（小鼠抗人外膜細胞；IgM）
（3）羊抗小鼠IgG-結合或大鼠抗小鼠IgM-結合磁珠
6.培養瓶或培養皿；
7.手術刀片和刀柄；
8.70μm細胞濾網；
9.回轉式混合儀；
10.Dynal MPCR-1磁分離器
實驗方法：
1.用手術刀片將牙髓組織切成小碎片；
2.將剪碎的組織放入膠原酶/中性蛋白酶混合溶液中（1：1）；
3.37℃孵育30—60min，間歇地搖勻組織/消化酶混合物；
4.消化后，加入足夠的MSC培養基，終止酶的活性；
5.將懸液經70μm細胞濾膜過濾，去除細胞碎片，得到單細胞懸液；
6.500g離心6min；
7.倒掉上清液，用MSC培養基重懸細胞。然后進行免疫磁珠分選；
（1）和能與DC細胞反應的一抗孵育，包括STRO-1（小鼠抗人MSC；IgM），CC9（小鼠抗人CD146/MUC-18；IgG2a），或3G5（小鼠抗人外膜細胞；IgM），20μg/ml，冰上孵育1h；
（2）用含1%A的A洗兩遍，600g離心6min；
（3）羊抗小鼠IgG-結合或大鼠抗小鼠IgM-結合磁珠的任意一個二抗孵育，4℃回轉式混合儀40min；
（4）根據產品說明書推薦的方案，通過Dynal MPCR-1磁分離器分離結合磁珠的細胞；
8.細胞計數，按（1&time10）&time103個細胞/cm2密度接種到培養瓶或皿上；
9.在MSC培養基、37℃和5%CO2的培養箱中培養；
10.細胞分離后7天，用A洗培養瓶，更換培養基。之后可以一周兩次更換培養基，直至細胞達到匯合。