【基本原理】
本法是用純化或重組的IL-2R(α鏈,P55,CD25,Tac抗原)蛋白包被96孔酶標反應板,同時加入已知量的抗IL-2RMcAb,再分別加入sIL-2R標準品與待測樣品。則待測sIL-2R或者sIL-2R標準品與包被的純化或重組的IL-2R蛋白競爭與抗IL-2R
McAb結合。通過與標準品對照,從抗IL-2R McAb與包被的純化或重組的IL-2R蛋白結合受抑制程度來求得待測樣品中sIL-2R含量。
【材料和試劑】
(1) 純化或重組的IL-2R蛋白(α鏈,P55,CD25,Tac抗原)(40.000u/ml)
(2) FITC標記的抗IL-2R McAb(0.2μg/ml):FITC為異硫氰酸熒光素,這里僅作為半抗原使用,而不作為熒光素標記。
(3) 堿性磷酸酶標記的兔抗FITC抗體(酶標抗體)
(4) 對硝基苯磷酶鹽底物液;用pH9.8的二乙醇胺緩沖液溶解,配成濃度為1mg/ml。
(5) 1%牛血清白蛋白-(1%A-):為封閉液點稀釋液
(6) 不同倍比稀釋度的sIL-2R標準品:以1% A-稀釋。
(7) 洗滌液(0.05%Tween20-)
(8) 待測sIL-2R樣品
(9) 96孔酶標板(聚苯乙烯板),酶標儀,波長465nm濾光片
(10) 刻度吸管,毛細吸管,加樣器(頭),4℃冰箱
【操作步驟】
(1) 以一定濃度的純化或重組的IL-2R(P55)蛋白包被96孔酶標板,100ul/孔,4℃過夜(16-72h);
(2) 棄包被液,用1%A-封閉非特異性結合位點,200ul/孔,置室溫2h;
(3) 用洗滌液加滿各孔置3min,然后傾去,反復洗滌3次;
(4) 分別加入不同稀釋度的sIL-2R標準品及待測樣品,50μl/孔;
(5) 各孔均加入FITC標記的IL-2R McAb,50μl/孔,充分混勻后置室溫2h;
(6) 同上洗滌3次;
(7) 各孔均加入堿性磷酶酶標記的兔抗FITC抗體,100μl/孔,置室溫1h;
(8) 同上洗滌3次;
(9) 各孔均加入底物液,100μl/孔,置室溫15-30min;
(10) 用酶標儀以波長405nm測各孔OD值。
【結果分析】
(1) 以sIL-2R標準品各稀釋度對應的濃度值為橫座標(X),相應的OD值為縱座標(Y),在普通座標紙上繪制競爭抑制標準曲線,OD值隨標準品sIL-2R濃度升高而降低。
(2) 根據待測樣品所測得的OD值,在標準曲線上查得樣品sIL-2R含量。
(3) 本方法測定sIL-2R含量時,不需要計算抑制百分率。
【注意事項】
(1)
本方法的敏感度低,大約為5000u/ml,大大低于雙抗體夾心ELISA法(10u/m)。因此不適合檢測正常人標本中sIL-2R含量,僅適用于檢測sIL-2R含量極度增高的樣品,如接受抗IL-2R抗體治療、毛細胞性白血病等患者標本,或作為監測移植排斥反應的一個指標。
(2) 若無純化或重組的IL-2R蛋白,可用PHA刺激的外周血單個核細胞(或MT-2細胞)包被96孔酶標板,吹干,固定,再用1% H2O2處理以抑制內源性過氧化物酶后即可使用。
(3) 其余多見雙抗夾心ELISA法測定sIL-2R含量部分。
(4) 試劑配制多參見TNF-α的免疫學檢測部分。