以下問題是以Promega公司試劑盒為例。
凝膠遷移實驗
1)什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗？
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。
2)作這樣的實驗需要什么試劑？
凝膠遷移實驗需要的結合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質抽提液。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶來作末端標記，同位素標記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe?/sup系統（a,b）（目錄號P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素標記的RNA的體外合成，DNA5`末端標記系統（目錄號U2010）用于制備DNA探針，結合反應所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非離子去污劑。在結合蛋白和同位素標記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage?/sup分析。
3)凝膠遷移實驗系統提供了什么試劑？
Promega公司提供一種凝膠遷移實驗系統檢測DNA結合蛋白，系統可作為這類實驗的 一種正對照。系統包括目的寡核苷酸，對照DNA結合蛋白，結合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標記所需的試劑。Core 系統（目錄號E3050）包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結合緩沖液（5′），和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete系統（目錄號E3300）含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID結合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記后用作特異性探針，或在競爭實驗中用作非特異性探針。參考凝膠遷移實驗技術手冊TB110獲取更多的資料。
4)成功進行凝膠遷移實驗，需要優化哪些因素？
凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優化一些參數，這主要受結合蛋白的來源和探針結合位點特點的影響。以下是需要優化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH, 聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）。總之，反應總體積應最小（20ul）。為滿足一般要求，結合緩沖液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作為優化實驗的起始。參考凝膠遷移實驗技術手冊TB110獲取更多的資料。
5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，這些引物的序列來源是什么？
有各類dsDNA探針，它們含各種轉錄調控因子的同源結合位點。下表列出了所能提供的探針，和這些引物序列的出處。
轉錄調控因子探針
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探針名 目錄號 序列（上鏈） 序列的出處
Sp1 E3231,E3232 5`-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3` SV40啟動子（1）
AP1 E3201 E3202 5`-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3` 膠原酶基因TRE（2）
AP2 E3211 E3212 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3`人金屬硫堇II a(3)
基因NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3`鼠Igk輕鏈基因（4）
Oct1 E3241 E3242 5`-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3` Ig重鏈基因（5）
CREB E3281 E3282 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3`大鼠生長激素抑制基因（6）
TFIID E3221 E3222 5`-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3`belta-1球蛋白啟動子
只列出了上鏈的序列，探針是雙鏈，下鏈序列和上鏈序列配對。黑體字表明序列來源于指定的基因序列，轉錄調控因子結合的序列用下線表明。一般而言，周圍的核苷酸是任意。
6)在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？
目的DNA的長度應小于300bp，以有利于非結合探針和蛋白DNA復合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應用短的寡核苷酸片段（約為25bp）,這樣結合位點可和其他因子的結合位點區別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區域內的蛋白結合位點定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結合的特異區域在DNA序列水平上作出分析。
7)用以下一些轉錄調節因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。
當用HeLa細胞核抽提物作為結合蛋白的來源時，每1個轉錄調節因子和它相關的DNA同源序列結合形成特征型的結合形態。以下的文字描述了每一個單獨的轉錄調節因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復合物的數目。
1．AP1：AP1（激活蛋白1）是一個轉錄調節因子，它結合的同源序列為5`-TGAGTCA-3`。當基因的啟動子區域存在AP1的結合位點時，這些基因可以被誘導，比如用佛波酯可誘導蛋白激酶C（2，7）。在細胞中，AP1形成c-Jun或Jun相關蛋白的同聚雙體，或者形成c-Jun或Jun相關蛋白和c-Fos或Fos相關抗原（Fras）的異源雙體。Fos蛋白自身不能形成同聚雙體，并不能單獨和AP1結合位點結合。c-Jun蛋白是一個40kDa的單體蛋白并通過亮氨酸拉鏈形成同聚雙體。在HeLa細胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚雙體。在凝膠遷移實驗中，形成一個特異的復合物。當作凝膠遷移實驗測定AP1的活力時，除了基本的溶液組分外，應將0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到結合緩沖液中。如用純化的蛋白，則用1-2ug的蛋白來檢測遷移復合物。
2．AP2：AP2是一個轉錄調節因子，可分別作為TPA-和cAMP誘導因子（10）。它是一個52 kDa的蛋白，識別的同源序列為5`-CCCCAGGC-3`或5`-GCCNNGGC-3`（3）。這個因子對視黃酸特別敏感，可能在形態發生中起著重要作用。HeLa細胞核抽提物和AP2同源DNA探針形成一個特定的復合物。用純化的蛋白作凝膠遷移實驗時，應用20-50ng的蛋白。
3．CREB：CREB是一個37 kDa的轉錄調節因子，對cAMP應答，識別5`-T（G/T）ACGTCA-3`DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉鏈結構而形成同聚雙體，相關的基本結構域和c-JunDNA結合結構域同源。當用HeLa細胞核抽提物時，能和CREB同源序列形成一個復合物。
4．NF-kB：NF-kB最初被鑒定為在B細胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強子結合。但隨后在非B-細胞的細胞質中被發現，形成NF-kB和IkB的復合物。最初在DNA結合蛋白復合物中分離的NF-kB是由p65(RelA)和p50構成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49（也可稱為p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75單體起反式激活作用。p50，p49（p52）單體具有DNA結合活力，但只具有微量的反式激活作用。據報道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉錄活力的異源雙體，類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細胞質中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調節。IkB和p65單體結合，阻制了細胞核中的定位和DNA的結合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結合。Poly(dI:dC)能抑制這一反應（14）。p49和p50也能形成同源雙聚體，但在細胞中的濃度很低。通常，在作NF-kB的凝膠遷移實驗時，在20ul的反應體積中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。當用純化的蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移復合物，而需用10ug的HeLa細胞核抽提物。凝膠遷移復合物在室溫中保溫30分鐘，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍色素的加樣溶液只能加入到陰性對照反應中，因這兩種色素會加劇NF-kB復合物的解離。當用HeLa細胞核抽提物作為結合蛋白來源時，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達p49，p50，p65的細胞中，可檢測到4個序列特異的凝膠遷移復合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高濃度的p65，可檢測到微量的p65/p65。下列試劑可加強NF-kB在體外的結合：mM的GTP，ATP，精胺，亞精胺，鋇或鈣離子，ng的Co+3(NH3)6（12）。
5．OCT1：OCT1是OCT轉錄調節因子家簇中的一員，顯然在哺乳細胞中存在比較廣泛（5）。POU結構域包括POU-box和Homeo結構域。當用HeLa細胞核抽提物時，可檢測到一個與OCT1同源探針形成的序列同源凝膠遷移復合物。
6．SP1：SP1是一個O-糖基化的轉錄調節因子，它識別10個核苷酸長度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`（1）。核心識別序列是5`-GGGGCGGG-3`。同核心序列相似的序列常存在于啟動子中。SV40的早期啟動子就是一個例子，它是第一個可以結合SP1的啟動子。根據糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA結合結構域中的三個鋅指紋決定了序列的特異性。HeLa細胞核抽提物與SP1同源探針形成特異的凝膠遷移復合物。
7．TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是基本的轉錄調節因子，參與RNA聚合酶II啟動子的基本的轉錄（16）。TFIID與真核啟動子的TATA區域形成特異的DNA結合。TFIID由幾個蛋白組成，而其中的TATA區域結合蛋白（TBP），參與TATA序列的結合。TFIID的其他的蛋白組分被稱為TBP-相關因子（TAFs）。用TFIID探針寡核苷酸和HeLa細胞核抽提物，可得到一個微弱的凝膠遷移帶，但很難確定為是TFIID序列特異凝膠遷移復合物。純化的重組的TBP很難作凝膠遷移實驗，這部分是由于TBP存在很強的正電荷，導致TBP/DNA復合物很難進入凝膠。純化的TBP形成二聚體后不能結合DNA（17）。因此形成的二聚體可參與DNA結合。TFIIB不單獨與DNA結合，但與TFIID結合后增強它與DNA的結合。
TFIIB與預啟動復合物結合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF結合到轉錄啟始區。故TFIIB在預啟動復合物的形成中有重要作用。當用純化的TFIID作凝膠遷移實驗時，poly(dI-dC)不用加入結合反應中。結合緩沖液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。對TFIID的凝膠結合實驗中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的復合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，凝膠組分是：0.5′TBE, 6%聚丙烯酰胺凝膠(19:1丙烯酰胺:雙叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 電泳緩沖液組分是：0.5′TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。當研究含TFIID和TFIIB的復合物時，應從結合緩沖液，凝膠，和電泳緩沖液中去除MgCl2。這些是一般的要求，用不同的細胞抽提物和TFIID、TFIIB形成復合物作凝膠遷移實驗時，應對多種因素進行優化以達到理想的條件。
8)在一次凝膠遷移實驗中，用多少量的蛋白質或抽提物，和標記的DNA探針？
對每一個特定的結合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優化，一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白形成特異的復合物。所加入反應的探針的量是50，000-200，000cpm32P-標記的探針（高特異活性），反應體積為1-5ul。這相當于10-50fmoles的DNA探針。探針應保存在-20oC以防止降解，在合成或標記后1-2個星期內必需使用。無論探針或是結合蛋白應避免多次凍融。
9)能用體外翻譯法制備目的蛋白質嗎？
Promega沒對所有的轉錄調節因子作這類測試。一般，用麥胚抽提物作哺乳細胞轉錄因子或DNA結合蛋白的體外翻譯，兔網織紅細胞溶裂解液可能含有內源哺乳細胞轉錄因子或DNA結合蛋白。但TNT？/sup>兔網織細胞溶解液系統（a,b,c,d）與TranscendTM 生物素標記的tRNA(目錄號E3201)一同使用，翻譯了轉錄調節因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目錄號E3201）產生的遷移效果和重組的AP1相同（18）。TNT？/sup>T7偶聯的麥胚抽提物（b,c,d,e）在體外翻譯了c-Rel。這一蛋白特異地使免疫球蛋白k輕鏈增強子探針產生遷移。在c-Rel結合反應中加入體外翻譯的MAD-3（IkB家簇中一員）可干擾其相互作用。
10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA的功能是什么？
它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結構，可抑制蛋白對標記探針的非特異結合，避免假復合物。 在凝膠遷移反應中加入poly(dI:dC)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA結合蛋白結合，比如轉錄調節因子的非特異結合。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。為確定所形成的復合物的特異性，在含或不含增量的非放射性的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結合反應的競爭實驗。一般，非放射性的特異DNA是非標記的DNA探針，非特異的競爭DNA ，長度組成和DNA探針相同，序列不同。用非放射性的特異DNA能競爭掉，而用非特異的競爭DNA不能競爭掉的復合物，表明目的蛋白和同位素標記探針的特異結合。非特異結合能用特異DNA和非特異的競爭DNA競爭掉。結合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作優化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特異或非特異）的競爭DNA的用量也需優化或滴定，但競爭DNA通常是同位素標記的探針的10-1000倍（w/w）。其他類型的競爭DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝膠遷移反應，它們會帶有目的蛋白的結合位點。
11)用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開？
將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合，蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%（30：1丙烯酰胺：雙叉），在特定條件下可用高或低的濃度。PH, 聚丙烯酰胺的濃度, 丙烯酰胺：雙叉丙烯酰胺的比會影響復合物在凝膠中的遷移。大多數蛋白用10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時間和高的電壓（30-35伏的電壓），電泳時所用的TBE和TAE必需是新配制的，無沉淀。低的離子強度和丙烯酰胺基質的`箱子效果`有助于復合物的穩定。也可將TGE緩沖液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不穩定的蛋白/DNA復合物。可在4oC進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。加樣樣品液中的色素會導致不穩定復合物的解離，應用不含考馬斯蘭和二甲苯藍的加樣樣品液。當帶型不緊密出現拖尾時，表明復合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應。在含抽提液的帶中不含游離探針或復合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應在抽提液中和結合反應中加入相應的抑制劑。目前可用高強度瓊脂糖凝膠分離蛋白/探針復合物（Metaphor?/sup/agarose）。
12)如何在一個特定的復合物中確定一個蛋白質的存在？
部分純化的蛋白或粗制核抽提液和一個特定的探針可形成一個或幾個特異的蛋白復合物。多個復合物的存在表明蛋白降解，應在制備抽提液的溶液中和結合反應中加入蛋白酶抑制劑。確定復合物中蛋白的特征可能會困難，但有一些方法作這方面的研究。如有目的蛋白的抗體，可進行超遷移實驗，抗體和蛋白/探針復合物中的蛋白結合，使復合物的遷移延遲，形成超遷移。增量的抗體加入到結合反應中。抗體可加入到蛋白和探針反應后，也可將抽提物與抗體結合后，再加入探針。取決于抗體的特定的抗原決定簇，前者有利于超遷移復合物地形成，后者阻止復合物的形成導致原復合物的強度的減少。在大多數實驗中，應對抗體作滴定，先使抗體：蛋白的摩爾比為1：1，然后應需要增加抗體的量。當有純化的蛋白時，可用它們和實驗的帶型遷移復合物比較。除超遷移實驗外，復合物中蛋白的特征也可用UV交聯和標記轉移來分析。在均質標記的探針和細胞核抽提物保溫后，用UV照射使復合物交聯，隨后用DNA酶降解未保護的探針。需用均質標記的探針，因DNA酶會從末端標記的探針中除去標記。和保護的幾個核苷酸交聯的蛋白在變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離，干燥，放射自顯影。結合蛋白的分子量可和標準分子參照物比較。也可用目的蛋白的抗體對復合物作Western印跡分析（20）。如一個蛋白和DNA探針的特定序列結合，可用含保守結合序列的競爭寡核苷酸，以及突變體來確定它的特征。也可用定點突變將保守序列結合位點改變來研究復合物的形成。
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