GenomeBiology：RNAseq需要多長的讀長？

　　隨著新一代測序（NGS）的讀長在不斷增長，研究人員也開始糾結：到底多長的讀長才合適？雙端測序是不是優于單端測序？近日，康奈爾大學維爾醫學院的研究人員在《Genome Biology》雜志上發表文章，認為對于差異表達分析而言，讀長并非越長越好。不過，雙端測序和長的讀長無疑能改善剪接的檢測。

　　最初，新一代測序技術只產生25或36 bp的讀取，而且只能開展單端測序。如今，NGS的讀長在不斷增加，序列質量也在不斷改善。對于許多實驗而言，目前的標準讀長是雙端100 bp，有時甚至達到雙端300 bp。

　　選擇測序讀長，以及單端或雙端測序，成為研究人員面臨的主要問題之一。人們普遍認為，長的讀取能帶來更多的信息，而雙端讀取也產生了比單端讀取更好的結果。不過，隨著讀長的增加，試劑成本和運行時間也在增加。

　　為此，美國的研究人員決定看看長的讀取是否對RNA-seq差異表達分析更有益。他們利用SEQC測序研究的數據來調查讀長對RNA-seq結果的影響，并利用ENCODE聯盟的數據來驗證這些結果。

　　研究人員使用了101 bp的雙端讀取，并修剪它們，以模擬不同的讀長，并分離出讀取對，以產生單端讀取。對于每種讀長和配對狀態，他們評估了兩個標準樣品之間的差異表達水平，并將這些結果與qPCR的結果相比較。

　　在差異表達分析中，他們使用了100、75、50和25 bp的雙端和單端讀取。他們發現，25 bp太短了，無法有效用在大多數的RNA-seq應用中。除了25 bp，其他所有的讀長都表現出相似的準確性，而準確性也幾乎不隨著讀長的增加而增加。一旦單端讀取的長度達到50 bp，則之后的結果基本上不變。不過，與100 bp的雙端讀取相比，使用50 bp的單端讀取能夠節省一半的錢，相對可觀。

　　此外，研究人員也發現，剪接點的檢測結果與差異表達分析不同。剪接檢測依賴于序列組裝，因此較長的讀取會帶來更好的剪接結果。與較短的讀長相比，100 bp雙端讀取能檢測更多的剪接點。他們對兩個ENCODE樣品進行了相同分析，發現了一致的結果，證明這些結論有著廣泛的適用性。

　　研究人員認為，在RNA-seq研究中使用什么樣的讀長，這要取決于研究的最終目的。如果只需要差異表達基因的列表，那么50 bp的單端讀取就夠了，還能節省大量的資源。不過，剪接的檢測無疑需要雙端讀取和長的讀長。