HPLC與UHPLC轉換檢測三聚氰胺

發布時間：2020-03-09 23:06 原文鏈接： HPLC與UHPLC轉換檢測三聚氰胺

圖1. HPLC方法的譜圖。

本文開發了HPLC和UHPLC方法用于食品中三聚氰胺的檢測分析，兩個方法都能提供極好的線性，并能方便地實現方法的轉換。

2007年事件和近期三聚氰胺污染事件爆發后，大眾迫切需要能夠對食品中可能存在的三聚氰胺污染物定性定量的檢測方法。最近的三聚氰胺檢測方法包括LCMS和GCMS方法。GCMS方法要求對樣品進行衍生化，而LCMS方法因使用梯度洗脫而要求色譜柱每次運行后清洗和再平衡。

格雷斯開發了可兼容于MS檢測器的LC方法，使用的是既能用于HPLC系統也能用于UHPLC系統的HILIC填料平臺。三聚氰胺既可以使用以5μm粒徑HILIC填料填充的250x4.6mmID常規HPLC柱分析，也可以用1.5μm粒徑HILIC填料填充的UHPLC柱使用UHPLC系統或快速HPLC 系統進行分析。

圖2. UHPLC方法的譜圖。

兩個方法都能提供極好的線性，使用的等梯度洗脫方法節約了柱再平衡時間而有利于快速分析。

HPLC方法

此方法實現了使用HILIC色譜柱和與MS檢測器兼容的可電離流動相，滿足FDA方法要求。低UV 檢測顯示在上樣量40ng到100ug的范圍內有極好的線性。

UHPLC方法

與常規HPLC方法相比，UHPLC方法可將分析速度提高4倍。使用1.5μm粒徑的填料，最佳線性流速范圍能隨之擴展得到更寬的范圍。因此，可以在更快的流速下運行樣品而仍得到相當的柱效和分辨率。在上樣量5ng到1000ng之間，此方法顯示出極好的線性。

圖3. 9針平行進樣顯示良好的重現性。

HPLC方法轉換到UHPLC方法

近年來分析實驗室對快速LC系統的采納升級意味著在相當一段時期內實驗室內將同時并存多種LC系統規格即常規HPLC，UHPLC和/或替代的快速LC系統。在系統之間進行方法的轉移和優化并非是件簡單的工作，但是，如果使用的是多種粒徑規格<2μm, 3μm, 5μm和10μm的完全相同性質的填料，只要填料被填充于合適的柱硬件以適合不同系統性能，系統間方法的轉移就變得簡單易行：只要簡單計算出同等線性流速就可以實現在系統間的方法轉移、或是先在一個系統上開發優化方法然后轉移到另一個完全不同類型的系統上。

SPE方法凈化樣品

從不同的食品基質中用固相萃取方法提取三聚氰胺以獲得更準確的定量萃取。使用GracePureTM Cation-X，一種強陽離子交換樹脂，能提供更干凈、更濃縮的樣品。

圖4. 與常規HPLC方法相比，UHPLC方法可以提速4倍。

SPE柱規格

GracePureTM SPE Cation-X, 500mg/3ml（貨號：5138770）

#p#

樣品制備

稱取食品2g，與20ml1%三氯乙酸溶液和5ml乙腈混合，超聲萃取30min后，離心15min，取上清液以0.45μm濾膜過濾，得到樣品基質溶液。然后用三聚氰胺標準溶液加標，得到含量已知的SPE上樣溶液。

圖5. ELSD檢測器可用于三聚氰胺的檢測。

SPE操作步驟

小柱初始化：2倍柱體積的甲醇，然后2倍柱體積的水；

上樣：添加10ml加標樣品液，使其緩慢流過小柱；

#p#

清洗：3倍柱體積的水，然后2倍柱體積的甲醇；

洗脫：4ml甲醇：0.5M氨水（1 : 1體積比）。

HPLC分析條件

流動相：10mM醋酸銨：乙腈5:95（v/v）；HPLC柱：Alltima HP HILIC, 5μm, 4.6x250mm（貨號：86466）；檢測器：UV240nm；流速：1ml/min；柱溫：30℃；進樣：10μl。

圖6. 火腿腸、餅干、豬肉中三聚氰胺的萃取。

結論

本文開發了用于檢測三聚氰胺的快速、等梯度的UHPLC和HPLC方法。對三聚氰胺的檢測線性范圍為40~4000ng。因為Grace VisionHT HILIC UHPLC柱和Alltima HP HILIC柱的填料性質相同，在HPLC柱上開發的方法可以輕易地轉移到UHPLC柱上，反之亦然。與HPLC方法相比，UHPLC能提速4倍。這些方法中所使用的流動相可以與MS和ELSD檢測器相兼容。