實驗方法原理
滾動式循環放大（rolling circle amplification；RCA）法是一種能夠在恒溫條件下，使標記有寡核苷酸探針（與組織細胞內的核苷酸無相關性）的抗體（特異性一抗或第二抗）與組織細胞內的抗原結合后，在 DNA 聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸進行循環擴增，產生一條擴增的 DNA 序列拷貝產物，此時，標記在抗體上的寡核苷酸得到有效擴增（109 倍），擴增后的產物與后續加入的標記有示蹤物的寡核苷酸進行互補雜交，在抗原-抗體周圍形成眾多帶有標記示蹤物的雜交體，最后通過 IHC 方法再放大示蹤物（原理見圖 5-6）。該方法具有很高的敏感性和特異性。
實驗材料 寡核苷酸石蠟切片兔抗 FITC-AKP 結合物
試劑、試劑盒 GMBS氮氣Ellman’s 試劑特異性一抗谷氨酸鉀PBS核固紅φ 29 緩沖液φ 29 DNA 聚合酶Tris·HCl（含氯化鎂、左旋咪唑）
儀器、耗材 PD-10 色譜柱陰離子交換色譜柱 Q-sepharose
實驗步驟
1.1 標記抗體用寡核苷酸
5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3'
1.2 循環放大寡核苷酸
5'-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3'
1.3 帶有標記物的互補檢測用寡核苷酸
5'-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3'，（X=生物素），或用 5'-F ACTCTGAAGATCGCTTAT F-3'（F=熒光素）；或用 5'-HRP ACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3'（HRP=辣根過氧化物酶）。
2. 寡核苷酸與抗體的結合
連使用的抗體可以是特異性一杭，也可以是第二杭體，或其他的連接二抗。如抗地高辛（Dig）、抗熒光素（FITC）或抗生素（biotin）二抗。
2.1 抗體的脫鹽和活化
首先對抗體免疫球蛋白進行脫鹽，然后進行抗體活化，在 41 nmol 抗體分子中加入 410 mmol 的 GMBS [硫代-N-（4-馬來酰亞胺丁酰）硫代丁二酰亞胺。sulfo-N-（4-maleimidobutyryIoxy）sulfosuccinimide]，暗處，37℃，在氮氣中 30 min，移入室溫中繼續反應 30 min，用 PD-10 色譜柱（用 pH 7.5 PBS 平衡柱子）除去多余的磺化-GMBS，將活化抗體 4℃ 濃縮。此時每一個抗體分子中含有多個馬來酰亞胺，可以用 Ellman’s 試劑滴定活化抗體的量，主要測定抗體分子上的巰基。抗體活化后與寡核苷酸連接。
2.2 活化抗體與寡核苷酸結合
將 28.1 nmol 磺化 GMBS 活化抗體和 142 nmol 5'-硫醇寡核苷酸譜柱混合，總體積為 825 μl ，室溫中反應 2 h，隨后移入 4℃ 中反應過夜。
2.3 純化結合物
純化結合物一般先用陰離子交換色譜柱 Q-sepharose（先用梯度鹽洗柱，然后加樣，洗脫，收集結合物）。再用 Sephadex G-200 色譜柱除去游離的寡核苷酸。純化后混合物中寡核苷酸和抗體之比為 10:1，多數情況下，1 個抗體分子可結合 3～5 個寡核苷酸。
3. RCA 免疫組化染色
3.1 石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復后，PBS 洗 3×3 min。
3.2 滴加特異性一抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 洗 3×3 min。
3.3 滴加適當稀釋的寡核苷酸標記二抗 IgG 200 nmol/L（用 100 mmol/L 谷氨酸鉀-PBS 稀釋）、37℃ 孵育 30 min，PBS 洗 3×3 min，用 100 mmol/L 谷氨酸鉀洗。
3.4 循環寡核苷酸（170 mmol/L），用 φ29 緩沖液稀釋 [緩沖液內含 250 mmol/L（pH 7.5）Tris-HCl，50 mmol/L MnCl2，1 mg/ml BSA，1 mmol/L dATP，1 mmol/L dCTP，1 mmol/L dGTP，0.75 mmol/L dTTP，0.25 mmol/L FITC-12-dUTP]， 40 μl/每片，37℃ 孵育 30 min，不洗。每張切片加入 1μl φ29 DNA 聚合酶（0.4 U/μl），37℃ 繼續反應 30 min，PBS 洗 3 × 3 min。
3.5 兔抗 FITC-AKP 結合物 1:1000 稀釋，37℃ 30 min；PBS 洗 3×3 min；0.02 mol/L Tris · HCl（pH 9.0 內含氯化鎂、左旋咪唑）洗 20 min。
3.6 NBT/BCIP 染色 30～240 min。核固紅襯染。
3.7 常規樹膠封片，結果觀察