在蛋白藥物的生產、存儲以及使用過程中，往往會發生產品的聚集、降解以及各種翻譯后修飾，導致其等電點及表面電荷分布特性發生改變，進而導致了電荷變異體的產生。相比于主峰來說，等電點較主峰高的組分稱為堿性變異體，等電點較主峰低的組分稱為酸性變異體。研究表明：抗體電荷的變化可以改變抗體與細胞的結合，從而影響抗體的組織穿透、分布和藥代動力學(PK)。電荷變異體對于蛋白質的功能影響與其翻譯后修飾的性質、修飾的位置和程度都有關，充分解析其形成的影響因素有助于蛋白藥物開發中對其電荷異質性進行控制和調整。因此，對蛋白藥物電荷變異體的分析顯得尤為重要。
2020版《中國藥典》——人用重組單克隆抗體制品總論中明確規定：需采用適宜的方法檢測供試品的電荷變異體，如cIEF、CZE、IEX-HPLC等方法。2025版《中國藥典》——通則3129 單抗電荷變異體測定法（公示稿）中詳細闡述了cIEF和icIEF進行電荷變異體分析的具體流程。在cIEF和icIEF方法中，可以使用已知等電點的標準品計算得到蛋白藥物準確的等電點信息，并能夠準確獲得酸堿變異體的含量信息；IEX-HPLC和CZE方法均能夠獲得不同酸堿變異體的含量信息，但是無法獲得等電點信息。上述提及方法均只能提供變異體的定量信息，但是沒法實現準確的電荷變異體鑒定。
為了更好的實現蛋白藥物電荷變異體的有效鑒定，科學家們先后發展了多種檢測方法。IEX-HPLC是一種經典的基于電荷差異進行分離的液相色譜分析技術，可以對不同電荷變異體進行離線收集，再結合高分辨質譜進行鑒定。在此期間，針對不同的蛋白藥物需要優化組分收集的液相條件，并且餾分收集后需要進一步采用cIEF或icIEF方法進行確認，流程非常復雜，耗時長，效率低。此外，基于icIEF分離原理的離線組分收集結合質譜鑒定的方法也同樣存在流程復雜，耗時長的問題，并且由于CE進樣量更少，組分收集和確認的時間也會更長。
近年來，為了實現蛋白藥物電荷異構體的鑒定，陸續出現了一些可以將cIEF和CZE方法與質譜系統進行在線聯用的毛細管電泳儀，但是均有不足。其中，基于cIEF-MS分析的儀器，一方面由于儀器硬件設計方面的原因，分離毛細管長度過長或盲區（從分離毛細管出口到達質譜錐孔的距離）較長，致使其峰型變差，并且儀器操作的簡便性欠佳；另一方面由于采用了壓力遷移的方式，進一步會影響到峰型，導致分離度和靈敏度均較低。CZE-MS方法目前雖然有商品化的儀器和方案，但是分離度遠不如cIEF，無法實現電荷變異體的在線聚焦，靈敏度明顯較cIEF-MS差；并且沒有光學檢測器，無法實現電荷變異體的定量分析。
為了更好的幫助生物藥企業實現蛋白藥物電荷變異體的快速高效鑒定，加快藥物申報進程，SCIEX于2023推出了高性能的Intabio ZT毛細管電泳質譜聯用系統，創新性的采用了微流控芯片作為分離通道，實現了在線直接聯用的icIEF-MS分析，并且與高分辨質譜ZenoTOF? 7600系統聯用成功的彌補了現有電荷變異體鑒定分析方法的不足（如圖1所示）。
圖1. Intabio ZT系統與高分辨質譜ZenoTOF? 7600系統的聯用示意圖
基于Intabio ZT系統而實現的icIEF-MS分析技術主要體現出如下優勢：
分析速度快：
30min內即可快速完成電荷變異體的深度表征；
簡單高效：
單針進樣即可獲得多個質量屬性：
UV檢測器：等電點(pI)、電荷變異體定量
MS檢測器：變異體的完整蛋白分子量、翻譯后修飾、N-糖型
分辨率高：
采用化學遷移方式，樣品峰型好，不影響分辨率；
盲區短（僅有4.6 mm），避免峰型展寬；
靈敏度高：
iCIEF通過聚焦對樣品進行在線濃縮；
Intabio ZT系統的超低流速帶來了超高的離子化效率；
icIEF-MS方法可貫穿于生物藥研發的多個階段，樣品消耗量非常少，特別適合早期研發過程中克隆篩選及工藝參數的優化。以下列舉了兩個具體的應用案例，充分展示了icIEF-MS在電荷變異體鑒定中的技術優勢。
案例分享1：化繁為簡——單抗電荷變異體快速高效深度表征及鑒定
圖2. NIST單抗icIEF-UV、icIEF-MS分析譜圖及去卷積譜圖展示
圖2詳細展示了Intabio ZT系統對NIST單抗電荷變異體的深度表征及鑒定結果，其中圖2A~C分別為icIEF-UV譜圖、icIEF-MS譜圖及其去卷積結果。通過圖2A和2B的比較，icIEF-UV譜圖和icIEF-MS譜圖呈現鏡像關系，分析結果一致。通過去卷積分析結果可以清楚地看到，堿性變異體的產生主要是由于C-端的賴氨酸未丟失引起的。酸性變異體主要來源于不同程度的糖基化，主要表現為高甘露糖糖型以及復雜糖型（如NeuAc/GlcNAc）。
以上結果可以看出：在SCIEX高性能的Intabio ZT系統上，僅需30 min，通過一針進樣即可獲得蛋白藥物的多種質量屬性，包括等電點、分子量、糖型、翻譯后修飾等信息，分析時間快，檢測效率高。
圖3. Intabio ZT系統重復性結果展示
圖3主要展示了在3套Intabio ZT系統上、各使用了3個卡盒、每個卡盒各運行了20針測試，共計180針分析的重復性結果。可以看出在不同儀器上、使用不同的卡盒、同一卡盒的不同測試間均表現出優異的重復性。圖3B為不同酸堿變異體的相對含量對比結果圖，可以看出Intabio ZT系統電荷變異體定量分析的結果一致性好。通過右表可以看出，不同酸堿變異體的pI值RSD均小于1%；主峰的峰面積百分比RSD小于2%。
結果證明：在SCIEX Intabio ZT系統上，蛋白藥物電荷變異體的定性和定量分析結果的重復性好。
案例分享2：快速監控ADC藥物中小分子毒素的偶聯情況及其電荷異構體鑒定
圖4. 某賴氨酸偶聯ADC icIEF-MS電荷變異體鑒定結果展示
ADC藥物是通過連接子將具有生物活性的小分子藥物偶聯至單抗上而產生的，其生產工藝復雜，小分子藥物的偶聯以及各種翻譯后修飾（糖基化、糖化、脫酰胺化等）的發生，將會導致ADC藥物的電荷異質性明顯增強。如何快速高效的研究ADC藥物的電荷變異體，是很多ADC制藥企業迫切需要解決的問題之一。如圖4為某賴氨酸偶聯的ADC藥物icIEF-MS分析的結果，通過對圖4A和4B的比較可以看出：偶聯了小分子藥物之后，ADC藥物的電荷異質性明顯增強，酸性變異體增多。
圖4C所示為icIEF-MS去卷積結果，可以清晰的看出：每一個電荷變異體中存在不同的糖基化形式，糖型主要表現為G0和G0F；Peak 0~8分別對應于偶聯不同個數小分子藥物（0~8個）的ADC變異體，隨著小分子藥物偶聯個數的逐漸增加，結合不同糖基化修飾的存在，對應ADC藥物電荷變異體的等電點逐也漸降低。
結果證明：借助于SCIEX高性能的Intabio ZT系統可以快速監控ADC藥物中小分子偶聯情況及其電荷變異體的準確鑒定。
通過以上案例分享可以看出，在線icIEF-MS分析可以非常快速高效的幫助生物藥企業進行電荷變異體的準確鑒定，從而可以有效加快項目進程。作為一款專門針對于完整蛋白電荷變異體鑒定而設計的毛細管電泳系統，Intabio ZT系統的儀器特點如下：
性能優良的電荷變異體分離系統，可用于完整蛋白的深層次表征
可同時實現icIEF-UV/ icIEF-MS分析，兼顧電荷變異體定性和定量；
采用化學遷移的方式，保證了電荷變異體的高分辨率；
超低流速帶來了優異的離子化效率，保證了分析結果的高靈敏度；
與經典電荷異質性分析方法（cIEF/iCIEF）無縫銜接：
常規的iCIEF-UV譜圖可與傳統的iCIEF結果相媲美；
具有非常先進的成像系統，保證聚焦和遷移過程均可實時成像，有助于比較遷移過程中的峰型變化；
與SCIEX ZenoTOF? 7600系統連接，由于同一供應商提供，保證優質高效的支持服務
SCIEX提供全套的解決方案，包括硬件、軟件、試劑及耗材；
SCIEX提供全面完善的技術支持和儀器維修服務；
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