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  • 發布時間:2020-09-15 08:49 原文鏈接: JAM檢測技術檢測原理和實驗方法

    JAM檢測技術是用于測定細胞死亡或凋亡的方法,如51Cr稀放法事基于細胞死亡往往伴隨有細胞膜破裂及細胞質的釋放,用51Cr或125I標記相關的靶細胞,與效應細胞共培養一定時間后,測定一定體積的培養上清中的放射性計數,以反映細胞損傷情況。而人們發現,細胞死亡的早期反應,細胞內DNA被酶裂解成180kb左右的小片段,這一變化發生在細胞膜破裂之前,因而在由CTL介導的細胞死亡早期,靶細胞首先表現為出現DNA碎片。檢測出靶細胞的DNA碎片,對于CTL介導的細胞死亡應是一個更為靈敏、準確的方法。Duke等人曾用差異離心的方法進行檢測,但這一方法比較費時,不適合應用于較大樣品量的常規檢測。而Matzinger發現,可以用3H-TdR標記檢測細胞增殖的方法加以改進來檢測。
    (一)檢測原理:
    用真空抽吸玻璃纖維濾紙上被3H-TdR標記的靶細胞,以測定靶細胞DNA斷裂及細胞死亡。由于DNA被抽吸的過程中,DNA碎片可以通過抽吸穿過濾膜,因此只有來自于活細胞的完整的DNA被留在濾膜上,通過測定其cpm讀數,即可了解細胞DNA被損傷的程度以及細胞死亡情況。
    (二)實驗方法:
    1、靶細胞的培養及標記:
    靶細胞(通常為腫瘤細胞如P815),通常在培養瓶中,用適宜的培養基,37℃、5% CO2條件下培養,實驗前1天將其按(2.5-5)×105個/ml的濃度接種至24孔板中,培養1天后,向培養基中加入3H-TdR進行標記,使終濃度為2.5-5uCi/ml,不要攪動細胞,在37℃、5% CO2條件下繼續培養一定時間,直至使用前。對于生長較快的靶細胞,培養4-6h即可標記,一般則培養過夜。
    2、效應細胞的培養:
    常規分離獲得的C57BL/6大鼠脾細胞,按4×106個/空接種于24孔板中,以300Gy照射過的BALB/C大鼠脾細胞作為刺激細胞,培養5天后,于測試前將細胞收集按一定細胞數重新接種于96孔板中,100ul/孔,并進行一定稀釋以達不同的效/靶比(R/T),每組至少設3個平行孔。
    3、效應細胞、靶細胞作用:
    靶細胞標記結束后,輕輕地將細胞吸出,洗滌1次,再按1×105個/ml濃度重懸,向已含有效應細胞的96孔板中加入100ul/孔的靶細胞,在37℃、5% CO2條件下共同孵育1-4h。
    4、收獲:
    培養結束后,可用目前收集細胞用的細胞收集器將細胞及其培養基抽吸到玻璃纖維濾膜上,依次用雙蒸水。三氯醋酸、無水乙醇洗滌及固定濾膜,烘干后,加入閃爍液,用液閃計算儀進行測定。
    5、計算特異性殺傷率(%):
    特異性DNA殺傷率(%)=[(S-E)/S]×100%

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