LAK/TIL細胞的制備與活性測定：
淋巴因子激活的細胞毒性細胞（lymphokine activated killer，LAK)和腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor
infiltrating
lymphocyte，TIL)在機體的免疫防御中起著十分重要的作用，特別是在腫瘤免疫過繼療法中具有重要的應用前景，其制備及活性的檢測對于評價機體的免疫狀態具有重要的意義。以下主要介紹LAK/TIL制備的常規方法。
(一)主要試劑材料
1.試劑①IL-2；②RPMI-1640；③ Ⅰ、Ⅳ型膠原酶，DNA酶；④四甲基偶氮鹽；⑤酸化異丙醇：含0.04mo1/L HC1的異丙醇；⑥96孔細胞培養板。
2.腫瘤細胞系Raji細胞、Daudi細胞為B細胞性白血病細胞株；Molt-4為T細胞性白血病細胞，對LAK細胞敏感，而對NK細胞毒作用不敏感；K562為紅白血病細胞株，對NK細胞毒作用敏感。所有細胞株均培養在含10%~20%
NCS的RPMI-1640完全培養液中，取對數生長期細胞經不完全培養液洗滌，臺盼藍染色計數，以含20%
NCS的RPMI-1640培養液調整細胞濃度至2×106/ml備用。
(二)外周血單個核細胞( PBMC )的制備及其LAK細胞的誘導
(1)肝素抗凝健康人靜脈血通過Ficoll-泛影葡胺密度梯度離心法分離PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度至1×106/ml。
(2)將上述細胞加人24孔培養板孔中，同時加人60ug PHA ，rhIL-2，終濃度為500U/ml，將細胞置37℃，5 %
CO2條件下培養，2~3d換液一次。吸棄1/2上清，加入含100U/ml的重組人IIr2 20%
NCS-RPMI-1640培養液，繼續培養3d，收集細胞，即為LAK。
(三)脾細胞的制備及其LAK細胞的體外誘導
將通過灌注去除紅細胞后的正常人外傷摘除的脾臟，按常規方法制備成單個脾細胞懸液，經離心洗滌后，用含20 %
NCS的RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度至1×106/ml，加人rhIL-2，終濃度為500U/ml，將細胞置37℃，5%CO2條件下培養，2~3d換液一次。
(四)TIL細胞的分離制備及其誘導
(1)無菌切取腫瘤組織，置于含抗生素的RPMI-1640培養液中。
(2)將瘤體機械法剪碎，用RPMI-1640調整體積為10~ 20m1，同時加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型膠原酶、0.001%的透明質酸酶和DNA酶，室溫攪拌4~6h。
(3)依次用80目和200目不銹鋼網過濾。
(4)經過濾后的細胞懸液以無血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min離心5~l0min。
(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培養液重懸細胞，將5ml比重為1.077的100%淋巴細胞分層液加人試管底層，其上緩慢加人75%的淋巴細胞分層液(用RPMI-1640配制)，然后緩慢加人上述腫瘤細胞懸液3~5ml。
(6)經1500~1800 r/min離心20min后，分別收集75%和100%淋巴細胞分層液界面層的TIL細胞和其上層的瘤細胞。
(7)用RPMI-1640洗滌2次，每次1500r/min離心5~10min。腫瘤細胞加人凍存液后液氮凍存備用。TIL則用含20% NCS的RPMI-1640調整細胞濃度為0.5 ×106/ml。
(8)將上述細胞懸液接種于24孔培養板(1m1/孔)，同時分別加人IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37℃，5%CO2溫箱培養3~4周，其間3~5d更換新鮮配制的含IL-2的RPMI-1640完全培養液。
(五)LAK細胞和TIL活性的測定
LAK細胞和TIL活性的測定基本同NK活性測定方法。但所用靶細胞為對NK不敏感的腫瘤細胞，如Rajf ，Dandi或自體腫瘤細胞。常采用同位素法如51 Cr釋放試驗、發光免疫測定法及MTT，比色法等。本節介紹MTT比色法。
(1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-1640調整LAK細胞或TIL濃度至1.5×106/ml。
(2)
LAK細胞或TIL與不同的白血病細胞株按效靶為1：1~20的比例分別取100ul接種于96孔平底培養板內共同培養，每個試驗做三個復孔。設不同濃度效應細胞200ul/孔單獨培養，測定效應細胞的吸光度。同時將不同的白血病細胞株分別用20%
NCS-RPMI-1640培養液調整至3
×104一1×105/ml，取100ul細胞懸液和100ul培養液接種于96孔培養板中，每個濃度接種3復孔，以測定不同濃度腫瘤細胞的吸光度。
(3)將上述接種好的細胞培養板置37℃，CO2溫箱孵育20h，其余步驟同IL-2生物活性測定。
(4)細胞毒性百分率(%)按下列公式計算
ODE + T=效應細胞孔OD值+靶細胞孔OD值
ODE=相應濃度單獨效應細胞的OD值
ODT=相應濃度單獨靶細胞的OD