Journal of Neuroscience Methods 151 (2006) 276–286
Application of multiline two-photon microscopy to functional in vivo imaging
Rafael Kurtz a,?, Matthias Fricke b,1, Julia Kalb a,2,
Philip Tinnefeld b,3, Markus Sauer b,4
a Lehrstuhl f¨ur Neurobiologie, Universit¨at Bielefeld, Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany
b Lehrstuhl f¨ur Angewandte Laserphysik und Laserspektroskopie, Universit¨at Bielefeld,
Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany
Received 3 November 2005; received in revised form 28 November 2005; accepted 4 December 2005
摘要
高空間分辨率和低的光損傷風險使得雙光子激光掃描顯微鏡TPLSM成為生物功能成像的選擇。但是，如神經鈣離子調控等功能性動態研究通常也需要一個高的時間分辨率。目前，通過線掃描可以獲取速度的提升，但是將結構的空間分辨率限制在一條軸上。為克服高空間分辨率和高時間分辨率間的空白，我們改進了TPLSM，使用一個多倍分光器來在樣品中產生多個激光焦點。通過使用一個電子倍增相機檢測這些焦點釋放的熒光，它可以支持同時進行多條線掃描。除了多線掃描，高達64束的陣列也允許使用X-Y掃描模式去以高的幀速獲取整幅圖像。為估測多線掃描TPLSM在功能性原位成像中的應用，監測了蒼蠅大腦中的視覺運動神經元中的鈣離子信號。以分枝狀軸突和棘突狀結構的測量為例展示了我們的方法對于從不同細胞位置同時獲取信號的能力。鈣離子動態依賴于分支大小，但是“棘突”與他們的“母軸突”并沒有系統性的區別。我們設備的空間分辨率與激光共聚焦顯微鏡進行了嚴格比較并通過運行成像和點掃描模式直接評估圖像檢測過程中釋放光散射的負面效應。
? 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Two-photon; Microscopy; Calcium imaging; Temporal resolution; Beamsplitter; Visual system; Invertebrate
1.導論
調查單個神經細胞和神經回路內的動態過程通常要求對神經活動具有高時間分辨率和空間分辨率的成像。傳統寬視野熒光顯微鏡對完整組織的空間分辨率受到光散射的嚴重影響。另一方面，時間分辨率受到CCD在弱光條件下獲取圖像所需時間的限制。
激光掃描顯微鏡尤其是TPLSM，在散射性組織中可能提供了比傳統成像方式更高的空間分辨率，并允許基于不同焦平面的圖像系列的三維重構(for review see: Halbhuber and K¨onig, 2003; Helmchen and Denk, 2002; Wright and Wright, 2002; Zipfel et al., 2003).激光掃描顯微鏡的更高的空間分辨率事實上取決于受到樣品內激光焦點限制的信號檢測（共聚焦顯微鏡）或激發本身（TPLSM）。
但是，成像速率是激光顯微鏡中的一個問題：例如，當激光沿著一個軸重復掃描時，只有在線掃描中，獲取率通常可以上升到每秒幾百個樣品。相對而言，掃描整幅圖像或者在Z平面進行圖像堆棧與傳統寬視場熒光成像同樣耗費時間。當在不能用單條線掃描完全涵蓋的多個神經結構功能性信號比較時，它存在很大的問題。不幸的是非同時性的多個線位置連續數據收集通常不是一個能說明問題的選擇，因為在實驗間變異性很大的神經元響應中它得出的結論太間接。(see e.g. Passaglia and Troy, 2004; Warzecha and Egelhaaf,1999). 在獲取整幅圖像時提高時間分辨率的技術，例如轉盤共聚焦顯微鏡，雖然有新的發展，在活樣品的致密組織應用中獲得的信號過于微弱。 (see e.g. Coates et al., 2004; Nakano, 2002).
在這個研究中，我們調查了是否多線TPLSM能夠幫助克服在功能性成像中時間分辨率和空間分辨率間的權衡。
多線TPLSM的原理以基于鏡面的光束分光器為基礎，它可以把一束激光分解成多束(Nielsen et al., 2001).在TPLSM中，激發內在性限定在激光很小的焦點處，這個分光器可以在樣品的焦平面上產生多個這種激發點。我們證明這種多焦點模式可以有效地用于同時執行多個線掃描。而且，使用多激光焦點掃描時圖像的獲取速度會提高，因為每條光線只掃描圖像的一部分，或者每個樣品點被多條光束成功激發。近來，一個相似的光束分光器設計已經被提議用到熒光壽命成像上。 (Leveque-Fort et al., 2004).
對正常動物的成像是功能性成像最具挑戰性的工作 (for review see: Helmchen andWaters, 2002).我們使用蒼蠅視覺系統的神經元鈣離子動態監測作為多線TPLSM的關鍵測試。Blowfly大腦中的視覺運動處理區域，小葉板，包含了60個大的可獨立識別的方向選擇性神經元，所謂的切向細胞TC。(for reviews see Borst and Haag, 2002; Egelhaaf and Borst, 1993; Egelhaaf et al., 1988, 2002, 2005). 這些神經元已經成為研究近乎自然狀況下神經信息處理的唯一模型系統。在電生理學與光學記錄實驗中，TC表現出作為運動感受器的功能，每一個神經元被以一種特殊的方式裁剪以適應來自移動中眼睛產生的動態模式的光流信息的精確明顯的組分(D¨urr et al., 2001; Egelhaaf et al., 1993; Krapp and Hengstenberg, 1996; Single and Borst, 1998). 由于來自外周局部動作敏感神經元的神經信號的視網膜拓撲取樣TC具有大的感受域。而且，TC間的相互作用大大增加了感受野的大小和動作特異性(Haag and Borst, 2001; Horstmann et al., 2000).
使用鈣離子成像作為TC局部樹突活化的標記(Borst and Egelhaaf, 1992; D¨urr and Egelhaaf, 1999; Haag et al., 2004; Single and Borst, 1998). 而且，有證據表明樹突鈣離子的增加卷入了活性依賴的動作靈敏度度的調控，如動作調整 (Kurtz et al., 2000). 突觸鈣離子濃度改變的成像已經被用于描繪感受刺激中的分級突觸傳遞的特點。(Kurtz et al., 2001). 在所有這種組織中，更高空間和時間分辨率的鈣離子成像將幫助我們得出更直接的結論，例如樹突輸入整合，突觸傳導中的鈣離子動態調控和通過鈣離子的動作調節的潛在時空控制。
除了它的優越性能和在致密組織的深層激發過程中降低的光損傷之外，由于使用近紅外波段激發，也避免了光感受器的視覺激發，TPLSM成為原位成像中的一種方法選擇，尤其適用于視覺系統。(see e.g. Denk and Detwiler, 1999; Euler et al., 2002). 通常，共聚焦和傳統成像通常伴隨著不需要的視覺激發，因為熒光染料的單光子激發光譜與光感受器的感受范圍存在很大的重疊。蒼蠅的視覺系統首次被用來通過單線掃描和一個雪崩二極管監測鈣離子信號來檢驗原位TPLSM成像(Kalb et al., 2004). 之后，Haag et al. (2004) 分析了條紋模式的動作中TC中的局部樹突鈣離子震動，以得出TC的局部動作檢測器輸入的計算模式。在后者的研究中，獲得了64×64像素的圖像，但是鈣離子成像的時間分辨率只有8Hz。相對的, Kalb et al.(2004) 獲得了高達400Hz時間分辨率的單線掃描圖像，空間分辨率限制在10um的一條線。當前的研究首次表明TPLSM中的多線原理可以被如何有效地應用以彌補神經活動功能成像中時間分辨率與空間分辨率之間的空白。