NBT特別關注丨6位大咖指引心肌干細胞領域“再生”

　　2018年，Anversa實驗室超過30篇文章由于造假而撤稿，這一事件對于心肌細胞治療領域帶來了非常負面的影響。在過去的18年間，許多醫生和科學家以此不實結論花費數年進行的科學研究變得毫無意義，不僅使病人蒙受了極大的損失，在該領域里投入的數百萬計資金也付之東流。然而，骨髓細胞或者是成體駐留的心肌祖細胞能夠轉分化為心肌細胞這一前提卻遠遠沒有被證明。論文作者對于此領域進行了回顧性分析，對問題出現的過程進行了詳細梳理，同時整合了現有領域的內容，正是為了警惕以后在論文編輯、同行評議、基金資助、學術單位中出現此類對于疑問視而不見的情況。同時，論文作者也建議以科學態度為驅動，以新的科研方法去面對心肌細胞再生方面遇到的難題。

　　再生醫學的終極目標是在生命受到損傷或者是疾病情況下修復損傷的器官和組織。但是對于心臟來說，心肌細胞治療領域急需“再生”——該領域由于超過三十篇關于成體血細胞或者是心臟內源干細胞能夠修復心肌損傷的不實報道而被嚴重損害。由于末期心臟衰竭對于心肌細胞再生的需求，加之心臟移植捐獻者數量極為有限，Anversa和他的同事們從2001年至今，似乎為病人、醫生和科學家帶來了曙光。在那時，除了造血干細胞治療之外，心肌細胞再生可能是干細胞基礎科學研究轉化為臨床實踐方面最閃亮的實例。然而，經過數十項臨床研究和(或)試驗以及近20年基本上毫無成果的工作，使得公眾對這一領域的信心明顯下降，全世界數百萬終末期心臟病患者的希望也隨之破滅。在這個心血管再生醫學領域的關鍵時刻，對這一生物醫學悲劇的發生進行清晰、坦率的回顧性分析是非常及時且有必要的。此文章的唯一目的是幫助避免在任何再生醫學領域的重復類似的錯誤，并為心肌細胞治療制定一個糾錯方案。

　　想法的扎根

　　造血干細胞可以向大多數或所有非血液組織進行轉分化的觀點是如何站住腳跟的?這一觀點根植于20世紀90年代末——干細胞領域的一個非常高產的時期。克隆羊多利的順利出生，證明了成體細胞具有被重編程為全能性干細胞的可能性。隨后，1998年人體胚胎干細胞也被成功分離。然而在當時還有另一種假說:即認為成體干細胞具有高度可塑性，當移植到新環境中時，可以“轉分化”成該位置的細胞。在千禧年，有一些報道對于造血干細胞轉分化成為腦、肺、肝臟等提出了假說。盡管這些假說并沒有被證明，然而這些假說帶來了“沒有什么不可能”的思潮。

　　深入研究，很明顯當時這些打破常規的研究與造血和移植學幾十年的工作背道而馳。造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）被分離出來后，被證明可以自我更新以及分化為生命所需要的所有血細胞類型。于是20世紀90年代，造血干細胞移植替代骨髓、動員后外周血或臍帶血移植在實驗室以及自體移植臨床試驗中進行了嘗試并獲得了成功。然而，造血干細胞可否分化為非血細胞？2002年的一項研究表明并沒有觀察到循環的造血干細胞向非造血細胞轉化。2005年，一項追蹤移植到小鼠體內的造血干細胞的研究也沒有發現造血干細胞能夠轉分化成血細胞類型以外的細胞。戲劇性的是，隨后發表的幾篇論文卻反駁了這些數據，聲稱造血干細胞可以轉分化為其它類型的細胞。

　　這些研究的發表，表明許多個人及組織并沒有采納干細胞生物學領域相關專家的建議。其中包括聲稱造血干細胞具有可塑性的研究人員，他們認為這些細胞在注入動物體內后可以轉化為其他組織的細胞；也有一些高水平的雜志推波助瀾，盡管許多干細胞領域的專家都發表了負面的意見，但是他們仍然接收了一些聲稱造血干細胞或者血液細胞能夠轉分化形成心臟、腦、腸以及骨骼肌的研究論文。有一些期刊拒絕關于首次分離人類胚胎腦干細胞的文章（這種再生能力嚴格局限于他們獲取的組織），但是卻發表另外的聲稱腦干細胞可以造血的論文（發表在Science雜志）。同時，應當受到譴責的也包括那些將大把資金用于聲稱能夠用非常簡單的策略比如將骨骼肌細胞轉入受傷的組織然后看會發生什么的基金組織。

基礎研究發現或臨床前研究支持或者反對心肌干細胞治療的時間軸。

　　不堪的歷史

　　基于幾個世紀的臨床和實驗觀察，長期以來，病理學家一直認為心臟是人體中再生能力最差的器官之一。然而，在90年代后期，Anversa研究組向這些學說提出挑戰，認為心臟是具有自我再生能力的器官。從2001年開始，他們發表了一系列文章聲稱人類心臟中含有高水平的處于有絲分裂期的心肌細胞，這些處在細胞周期中的細胞能夠變成心肌細胞，并且骨髓細胞能夠被血液形成因子誘導促進小鼠中的心臟再生。同年，Anversa研究組發表了一篇極具爭論的文章，他們表明受損的心臟能夠明顯地被表達c-kit的骨髓干細胞移植再生。盡管該結論只是基于單只小鼠的研究，該方法還是被快速的轉化為臨床試驗并于次年發表。這些原始的、簡單的、基于小鼠的工作,再加上當地的評審委員會對于臨床試驗管理方面的寬松處理,導致這項研究幾乎在沒有障礙的情況下進入了臨床試驗。這些試驗聲稱可以快速干預急性心肌梗死,因此該工作迅速被廣泛傳播和進入大規模臨床研究,其中的某些研究甚至還發表在一些主流醫學雜志上。

　　值得慶幸的是，同期有些研究者表明不能重復Anversa研究組最初的發現。2004年發表的三篇文章提供了直接的、明確的證據表示移植的骨髓細胞不能轉分化形成心肌細胞。但是，這些研究的基礎并不明確，因為這些發現完全依賴于骨髓細胞譜系的標記物與心肌細胞標記物的免疫熒光染色。眾所周知，免疫染色是一個比遺傳重組更加主觀和缺乏嚴格標準的檢測方式，同時在染心肌細胞時很難去除高度非特異性背景的干擾。為了克服這一困難，利用可追蹤的、特異性敲除的Cre-loxp重組酶系統鑒定心臟中的肌肉和非肌肉組分的心臟祖細胞，逐漸變成心臟干細胞和祖細胞身份鑒定的金標準。值得注意的是，可發育為大部分心肌細胞的胚胎心肌祖細胞在成體心臟中并不存在。

　　盡管這些發現都反駁了Anversa的結論并且將該科學爭論進一步升級，相關的臨床試驗并沒有放慢。而大量不可控的臨床試驗也只報道得到了一點有益的信號。這些結果后來被歸因于未知的“旁分泌信號”，而不是由于直接產生新的心肌細胞。正如下文所述，旁分泌可能通過增強血管形成、減少纖維化和促進心肌梗死后宿主心肌細胞的存活來提高心臟功能。

　　焦點的轉移

　　當臨床團體還在繼續研究骨髓細胞轉分化的可能，Anversa小組卻將目光從骨髓細胞轉分化轉移到了心臟干細胞，他們認為心臟本身包含一個同樣表達c-kit的干細胞群體。有趣的是，該實驗結論同樣是基于免疫染色和移植實驗，并沒有任何通過Cre重組酶細胞譜系追蹤等證據表明成人心臟c-kit+細胞是先天“干細胞”。在他們的研究中，他們認為這些成體的“心臟干細胞”，或簡稱CSCs，是取之不盡、用之不竭的，它們負責嚙齒動物以及人類正常、大規模的心肌細胞循環。此外，他們還聲稱，CSCs很容易識別和分離和便于移植。這些大膽且具有潛在重要意義的研究引發了大量實驗室與Anversa進行合作。同樣，這些研究報也聲稱，心臟中c-kit+細胞是可以使心臟再生的，只是結果并不那么顯著。同時，其他組也分離出更多的"CSCs"。也有一些研究在c-kit的基礎上加入了其它的造血細胞表面標記，如Sca-1；而另一些研究則證明CSCs可以生長為三維的心臟小球（cardiospheres）。

　　基于此，幾個小組進行了CSCs的臨床試驗。例如， Bolli研究組與Anversa研究組一起將心臟c-kit+細胞運送到慢性缺血性心力衰竭患者的心臟。他們報告說，與對照組相比，治療組的安全性良好，心臟功能明顯改善。正如下文所討論的，這些發現的真實性現在受到質疑。Marbán研究組在最近的心肌梗死患者中測試了心臟小球干細胞（cardiospheres）。他們報告說，這些細胞是安全的，但對整體心臟功能沒有好處。目前，這些臨床研究組仍在繼續。

　　最近，美國國立衛生研究院(NIH)發起了一項名為CONCERT-HF (NCT02501811)的臨床試驗，擬對慢性缺血性心力衰竭患者分別移植心臟c-kit+細胞、骨髓間充質細胞、兩者的混合，并進行比較。截至撰寫本文時，患者登記工作已基本完成，其中一名患者死于分離c-kit+細胞時進行的心臟活檢引起的出血并發癥。

　　大廈的崩潰

　　在接下來的幾年里，許多研究小組都難以證實心臟c-kit+細胞的干性。Menasché等人報道在心力衰竭患者中，心臟c-kit+細胞實際上是肥大細胞(即肥大細胞，成熟的常駐組織白細胞)。Lee研究組使用了一種高度敏感的技術，多同位素質譜，來證明成年小鼠的心臟更新非常緩慢，每年大約1%，而這種更新完全可以由先前存在的心肌細胞的分裂來解釋。該研究也證實了六十年代Rumyantzev研究組與九十年代Field研究組使用[3H]胸腺嘧啶測量心肌細胞DNA合成速率的研究結果。

　　2014年，van Berlo等人發表了一項備受期待的研究，利用Cre重組酶對小鼠心臟c-kit+細胞進行譜系追蹤。在這些小鼠中，通過注射他莫西芬，可以在表達c-kit的細胞中誘導一個可遺傳的基因標記。在非給藥時，可以追蹤被標記的細胞。作者發現，在正常衰老或心肌梗死等損傷后，c-kit+心肌細胞形成水平低于萬分之一，換句話說，沒有證據表明c-kit+細胞是心肌祖細胞。盡管Anversa和合作者對這項研究的準確性提出了質疑，但其他小組提供了進一步獨立的證據來反對c-kit+心臟干細胞假說，包括證明Sca-1+細胞也不是心臟祖細胞。

　　Bergmann等人通過研究大氣核武器試驗產生的放射性碳與心肌細胞的結合，估算了人類心肌細胞的DNA更新速率。他們發現，平均而言，心肌細胞比個體的年齡稍年輕，估計20歲時的年更新速率為1%，50歲時為0.5%。這直接挑戰了人類心臟是一個快速自我更新的器官的觀點。Anversa的研究組很快反駁了這一報告，并重復了這項研究。他們的發現與Bergmann等人的發現直接相反，Bergmann等人的發現顯示心肌細胞、血管細胞和結締組織細胞的更新速率同樣快(60年間為6-8次)。對這個領域的大多數人來說，這似乎是一個令人困惑的僵局；相反其實是一個戲劇性的突破擺在面前。

　　放射性同位素碳測定法需要復雜的質譜分析，這兩項研究都是由勞倫斯大學利弗莫爾國家實驗室(LLNL)完成的。當Anversa小組的論文發表在Circulation雜志上時，LLNL的科學家們意識到，他們生成的原始光譜與Anversa小組在論文中報告的光譜之間存在差異。而正是Anversa小組中的這個差異支持了其關于人類心肌細胞快速更新的假設。于是，LLNL向美國國立衛生研究院研究誠信辦公室報告了他們的擔憂。

　　隨后，Brigham and Women’s Hospital發起了一項為期5年的調查，最終得出結論Piero Anversa、Jan Kajstura和Annarosa Leri犯下了廣泛的科學不端行為。寫這篇文章時，該醫院宣布31篇論文將被撤回。完整的名單尚未公布，但irculation Research雜志和Circulation雜志最近也撤回了13篇論文。此外，NIH決定停止CONCERT-HF臨床試驗的注冊。該機構和數據安全監測委員會正在審查這項研究的科學基礎。

　　未卜的挽救

　　盡管發表在2004年的動物研究清楚地表明,骨髓細胞不能轉分化為心肌細胞,然而其臨床試驗仍然繼續有增無減。實際上,基于自體和異體細胞,包括骨髓間充質基質細胞、脂肪基質細胞以及之前討論的心臟細胞的新的臨床試驗正在啟動。但是，這些研究的科學依據已經完全改變了，從研究轉分化為心肌細胞，到“旁分泌假說”即細胞在其新位點只能存活幾天，并在死亡前會向周圍受傷的心臟組織分泌未知的有益旁分泌因子。這假說的提出是為了調和CSCs在很大程度上并沒有移植到心臟中，但在動物研究中確實對心臟功能有一些有益影響的發現。除了證明旁分泌作用可由培養細胞的胞外囊泡復制外，對其機制的研究很少。

　　雖然對成體細胞臨床試驗的詳細分析超出了這一觀點，但我們也得到了一些經驗。在對心臟功能或患者預后(如死亡率或再次住院)的影響方面，骨髓試驗一直處于邊緣、模糊或陰性的狀態。兩項獨立的雙盲安慰劑對照均未顯示心臟功能有所改善。此外，技術錯誤最多的研究反而報道了最正面的功能影響，這表明嚴謹性的缺失可能會導致對于實驗結果出現陽性解讀。雖然心臟源性細胞的試驗只有少數報道，唯一一項聲稱有益的研究來自于Anversa和Bolli研究組，也因為數據不規范，已被柳葉刀雜志標記為“表示關注”。 然而，要想繼續合理化地研究下去，有效的方法是通過回顧性分析(例如，以發現從高細胞劑量中受益的群體為突破口)，盡管這些研究從未被授權研究劑量增加對結果的影響，這也造成了如何挑選數據的難題。

　　遲到的歸責

　　事后看來，對導致和延續這一科學和臨床悲劇的環境進行仔細審查是必要的。這一事件的代價是巨大的：它浪費了原本可以用于支持更有前途的心臟修復技術的研究和臨床試驗的基金(可能是2.5億美元)；它對追求Anversa研究的一代年輕心血管醫生和科學家產生了令人沮喪的影響；它動搖了公眾對再生心臟病學的信心；最重要的是，它使成千上萬的患者處于危險境地，利用虛假的研究獲得以成體心臟干細胞為基礎的心臟治療得到了強有力的、令人信服的臨床前證據，使得這些患者相信并接受了一項有風險的臨床治療。

　　因此，所有有關機構都有責任仔細考慮如何通過執行更加專業和嚴格的程序以防止今后出現類似的錯誤。很顯然，晚期心臟病人急切的臨床需求，患者、醫生和科學家不切實際的幻想促進了這一事件的發生。處于絕望中的病人是可以理解的，但是作為醫生和科學家，我們除了有一腔熱血外，更應該從專業的角度審視我們的研究，并在開始臨床試驗之前有充足嚴格的證據。同理，各院校在聘任教師時，也應從客觀公正的外部專家那里獲得意見和建議。成體細胞可進行心臟修復觀點的支持者可以利用最新的干細胞技術，如譜系追蹤，來闡明c-kit+細胞在早期的作用。而旁分泌假說在進入臨床實驗之前也應進行徹底的機制研究。

　　另外，更正發表文章中的錯誤需要漫長的時間也指出了同行審查制度的重大缺陷。出版社對負面數據有強烈的偏見，越來越多的人傾向于發表宣揚突破性進展或打破常規結果的研究。許多情況下，被撤銷的來自Anversa小組的研究都是由包括合作者在內的編輯小組進行審查或處理的，這是一種潛在的利益沖突。在其他情況下，短暫的投稿-接受周期(例如，從提交到接受只需要一天)引起了嚴格和獨立的同行審查的問題。回顧過去，鑒于干細胞是跨領域和跨病種的技術，論文的發表以及教職的任命都應當聽從心血管生物醫學領域以外研究人員的意見

　　科學政策在這一事件中也發揮了作用。2001-2008年，聯邦對于hESC的經費進行了嚴格的限制，同時美國心臟協會采取了一項不資助hESC工作的政策，這項政策一直持續到今天。這些政策強調了成體干細胞適合作為再生治療藥物的觀點，并對多能干細胞研究的整個領域造成了巨大的資金障礙。

　　未來的道路

　　這一事件警示我們要充分認識到心臟細胞治療的多重挑戰和復雜性。要想成功地將心臟細胞療法應用于臨床實踐，需要解決科學-臨床-資金中的重重困難，比如如何識別最佳細胞類型、如何在體內輸送、如何進行長期觀察、如何選擇實驗動物、如何建立臨床標準、如何避免副反應等等。但是首先，必須有一個獨立的、可重復的有效發現。

　　目前，人心肌祖細胞或心肌細胞的唯一可靠來源是多功能干細胞。多個獨立的實驗室已經開發出幾乎可以產生任何心肌祖細胞或亞型(心室、心房、起搏器)的方案。目前有證據表明，在包括靈長類動物在內的大型動物模型中具有明確的體內功能，以及初步的臨床安全性數據。但這些研究仍處于早期，存在嚴重問題(如心律失常發生、免疫抑制、最佳給藥、細胞純化、可擴展性、批間變異、長期生存能力)，然而這些問題都可以通過嚴格的實驗來解決。對于研究人員來說，這意味著需要與生物制藥行業建立伙伴關系。生物制藥行業在監管、安全和毒理學方面擁有豐富的專業知識，并擁有嚴格的臨床試驗設計。這種實時的、交互式的協作可能比單獨的學術努力更可取，同時這樣也可以開發出一種全新的的治療方案。

　　多個獨立實驗室的早期實驗研究已建立了新一代心臟修復和再生的策略，包括使用人類心臟祖細胞和從多功能干細胞中提取的心肌細胞；心臟貼片組織工程；利用蛋白、基因和修飾mRNA的旁分泌因子療法；成纖維細胞向心肌直接重編程；釋放細胞周期檢查點促進心肌細胞復制等方法。雖然每種方法都有其固有的優點和缺點，但同樣可以通過嚴格的實驗來批判性地解決這些問題。

　　目前，依然很難平衡心臟細胞療法的前景、科學、監管和財政帶來的挑戰。然而，有一件事是清楚的，就像基因治療和腫瘤免疫治療一樣，它需要跨學科的發現、長期的資助以及學術與企業的合作。如果心臟再生療法能夠堅持走科學的道路，也許我們真的可以為晚期心力衰竭患者提供新的希望。