Nature?Methods：兩種新型?CRISPR?脫靶效應的分析方法

　　昨日，在 Nature Methods 同時刊登的兩篇研究中，發表了兩種分析 CRISPR/Cas -9 基因組編輯脫靶效應的新方法。其中一種方法可以鑒定細胞類型特異性 SNP 相關的脫靶突變，另一種則可以檢測潛在脫靶切割位點。

　　第一項研究中，來自麻省綜合醫院（MGH）和哈弗大學的研究人員開發了一種通過測序體外檢測切割效應的方法，稱作 CIRCLE-seq，該方法是一種高度靈敏的體外篩查法，比現有識別 CRISPR/Cas9 全基因組脫靶突變的細胞學或生化方法更有效。

　　“與之前的體外方法不同，我們所展示的 CIRCLE-seq 可以使用下一代測序技術，并且不需要參考基因組序列。”作者在文章提到，“更重要的是，CIRCLE-seq 可以用來識別與細胞類型特異性 SNP 相關的脫靶突變，進而證明個性化的特異性分析的可行性和重要性。CIRCLE-seq 提供了一種快速、全面可行的識別全基因組范圍 CRISPR/Cas9 脫靶突變的方法。”

　　研究人員檢測了新方法的靈敏性，將靶向 HBB 基因的 sgRNA 的脫靶結果與利用另一種方法 Digenome-seq 識別的脫靶結果進行比較。他們發現 CIRCLE-seq 鑒定出了 Digenome-seq 已檢測到的 29 個位點中的 26 個，并且還檢測到 156 個其他方法無法檢測的新位點。

　　研究人員表示，“這些結果表明，與 Digenome-seq 檢測到的結果相比，CIRCLE-seq 具有更高的信噪比，而且使用的測序 reads 減少了一百倍，這可能是由于該技術在識別全基因組范圍脫靶位點方面具有更高的靈敏度。”

　　第二項研究中，來自馴鹿生物科學實驗室和美國杜邦公司的研究人員描述了一種生化方法，稱作 SITE-Seq，該技術使用了 sgRNA 編程的 Cas9 對基因組 DNA 中的剪切位點序列進行識別。

　　“我們使用 SITE-Seq 檢測靶向人類基因組的 sgRNA 與 Cas9 的特異性。識別的位點數量依賴于 sgRNA 序列和核苷酸濃度。低濃度條件下鑒定到的位點更有可能是細胞中的脫靶突變。”研究小組說，“細胞中具有活性的脫靶位點會受到 sgRNP 傳遞、細胞類型和在核苷酸環境接觸的持續時間影響。總而言之，我們的結果強調了在評估核苷酸活性和特異性時，將全面的脫靶位點生化識別方法與基于細胞的活性檢測方法結合的有效性。”

　　SITE-Seq 過程包括了選擇性的標記、富集、測序，以及將將切割后的基因組 DNA 與對應的參考基因組比對。最終比對結果中，sgRNP 切割產生的位點會生成一個特殊的信號，可以通過計算檢測，研究人員還表示，這個信號與 Digenome-seq. 檢測到的信號相似。

　　此外，研究人員在 Cas9 消化處理的人類胚腎基因組 DNA 中檢測了該方法，結果發現 SITE-Seq 靶向的 771 個生化切割位點。研究人員接下來將 AAVS1 sgRNA 轉染到穩定表達 Cas9–GFP 的 HEK293 細胞中，3 天后進行脫靶編輯。他們從最初的 771 個包含大范圍核苷酸替換的位點中選擇了 68 個位點進行評估，發現 29 個細胞脫靶位點的突變頻率在 0.1%~66.6%。

　　研究小組在文章提到，“綜合考慮，這些數據表明 SITE-Seq 可以確保檢測到所有的 sgRNP 生化切割位點，進而精確定位這些在細胞環境中積累了脫靶突變的靶點。”

　　Caribou 公司總裁兼 CEO Rachel Haurwitz 表示，“這項研究證明 CRISPR-Cas9 是一種安全且有效的基因編輯工具。通過向研究人員提供一種精確定位 CRISPR–Cas9 活性的基因組區域，我們可以選擇活性和特性行最高的靶點來減少脫靶效應的發生。”