Nature|轉移灶示蹤新方法發現具有干細胞特性實質細胞

　　腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）不但為腫瘤細胞提供了生存和增殖的土壤，還可以改變腫瘤細胞的增殖和侵襲行為，二者之間的相互作用促進著腫瘤生成、遷移轉移、血管生成、免疫抑制及靶器官選擇等過程發生。以往的多項研究表明，微環境中如激活的成纖維細胞、周細胞、內皮細胞、炎癥相關細胞等多種類型細胞都能夠影響腫瘤細胞的特性【1】。腫瘤細胞轉移早期，會在腫瘤細胞周圍形成轉移龕/局部TME（metastasis niche/local TME），這種環境不同于正常的組織結構，能夠極大的促進腫瘤生長【2】。然而，目前，還沒有針對轉移微環境內細胞示蹤和組成詳細分析的研究，尤其是缺乏對轉移早期過程中的微環境內細胞變化的研究。

　　近日，來自英國 The Francis Crick Institute的 Ilaria Malanchi團隊在 Nature雜志上發表了名為 Metastatic-niche labelling reveals parenchymal cells with stem features的研究論文，該研究團隊通過改造具有轉移能力的腫瘤細胞，使這些細胞能夠釋放出具有細胞穿透性的熒光蛋白，這些熒光蛋白隨即被腫瘤周圍臨近細胞所攝取，進而使得腫瘤細胞周圍微環境空間內細胞變得可視化，研究人員在乳腺癌肺轉移模型中對這個方法的可行性進行了充分驗證，并發現了一類具有干細胞特性、能夠自我更新、具有多譜系分化潛能的腫瘤相關實質細胞（parenchymal cells）。

　　為了更好地辨別腫瘤細胞的周圍細胞，研究人員首先開發了mCherry標記微環境系統（mCherry niche-labeling system）：sLP-mCherry （secreted lipid permeable  -mCherry）。這個系統包含了一種合成的帶有mCherry熒光的分泌蛋白，這個蛋白同時攜帶有一段修飾過的具有脂質穿透性的反式作用元件轉錄肽段（TATk）。將乳腺癌細胞4T1共表達sLP-mCherry和GFP后與未標記細胞進行共培養發現，具有標記的癌細胞分泌出的sLP-mCherry蛋白能夠進入到周圍未標記細胞，細胞內熒光半衰期為43h并能持續保持高熒光強度。更重要的是，將這種sLP-mCherry+GFP+乳腺癌腫瘤細胞尾靜脈注射到動物體內，構建乳腺癌肺轉移模型過程中發現，這些細胞能夠很好的影響其周圍未標記組織細胞，大約能夠影響其周圍由內向外五層細胞層，且隨著腫瘤微轉移范圍的擴大，mCherry+細胞也在等比例增加。由此證明，這種方法能夠很好的標記局部腫瘤轉移灶，使得組織內空間細胞組成和同一組織內標記細胞和未標記細胞的比較分析成為可能。

　　接下來，研究人員通過使用這個系統，對腫瘤細胞肺微轉移組織內腫瘤周圍細胞組成進行研究分析。以往的研究發現，肺中性粒細胞（neutrophils）對于能夠促進腫瘤細胞轉移【3,4】，因此，本研究將腫瘤細胞周圍mCherry+中性粒細胞和同組織未標記的中性粒細胞分別分選出進行比較后發現，mCherry+中性粒細胞具有更高的氧化磷酸化和活性氧化物水平，這些都更有利于腫瘤細胞的生長和增值。除了免疫細胞（CD45+）變化外，腫瘤轉移過程中的其他類型細胞也得到了比較和分析。為了更好的研究腫瘤轉移發生發展這個過程中的變化，研究人員將肺轉移模型分成不同的階段，即早期肺腫瘤細胞聚集（Day5）、肺微轉移形成（Day7）、晚期肺大轉移灶形成（Day10）。同樣的，研究人員將早期和晚期內mCherry+和mCherry-的非CD45+細胞進行單細胞測序分析發現，在腫瘤轉移早期細胞，腫瘤細胞周圍的其他細胞已經明顯向有利于腫瘤細胞生長和轉移的方向變化，比如轉移灶內mCherry+細胞高表達WNT1-induced protein （ISP1），同時，GSEA信號通路分析發現mCherry+細胞內有大量肺上皮細胞相關信號通路發生變化，且微轉移灶主要集中在肺泡部位，并高表達上皮細胞黏附蛋白標記EPCAM，這些結果預示，肺轉移灶腫瘤細胞微環境內腫瘤細胞周圍細胞具有上皮細胞特性。

　　為了更好的辨別這類細胞，研究人員進一步對這部分mCherry+上皮細胞進行分析發現，他們不但具有更強的增殖能力（Ki67+），且Epcam+細胞能夠促進腫瘤細胞的生長。單細胞RNA測序分析發現，mCherry+Epcam+細胞主要分為Cdh1+和Cdh1 -（E-cadherin，上皮細胞特有標記）兩種細胞群，其中mCherry+Epcam+Cdh1+細胞和未標記遠端肺Epcam+細胞表達有相同的肺泡基因，相反的，mCherry+Epcam+Cdh1-細胞則大量表達前提細胞基因Ly6a和Tm4sf1，并低表達肺泡細胞相關標志物。由此證明了肺轉移灶內存在一群去分化的上皮細胞，在這里，作者將他們定義為腫瘤相關實質細胞（cancer-associated parenchymal cells, CAPs）。

　　接下來，研究人員從功能上對CAPs這類細胞進行了研究。通過使用3D類器官共培養技術，發現了和CD31+細胞共培養后，和未標記的Epcam+細胞主要生成的肺泡型（alveolar）類器官不同，CAPs（mCherry+Epcam+）細胞更傾向于生成具有多譜系的支氣管肺泡型（bronchioalveolar）類器官。類似的，在腫瘤細胞的刺激下，Epcam-細胞也可被誘導成為CAPs細胞，并生成支氣管肺泡型類器官。通過進一步對譜系標記（Sftpc-CreERT2 lineage cells）的上皮細胞AT2 （alveolar type II cells）進行同樣試驗后發現，這些細胞在腫瘤細胞刺激下也能夠生成支氣管肺泡型類器官，由此證明了CAPs來源于激活的AT2細胞。

　　總的說來，本研究開發了一種mCherry標記微環境系統，并驗證了這個系統在辨別腫瘤細胞周圍環境細胞組成和功能等研究方面的有效應用，為研究腫瘤轉移微環境研究提供了有力武器。通過使用這種方法，在乳腺癌肺轉移灶內發現了一類來源于AT2細胞的CAPs，這類細胞具有干細胞特性，不但能夠自我更新和大量增值，同時具有去分化特性和多分化的潛能，進而促進腫瘤細胞增值和轉移。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41586-019-1487-6

　　制版人：小嫻子

　　參考文獻

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