NatureMethods：全面檢測CRISPR脫靶效應的新策略

　　CRISPR/Cas9基因組編輯目前正應用得如火如荼，但若要轉化到臨床應用，準確檢測脫靶效應則是必不可少的。近日，麻省總醫院的研究人員開發出一種新策略，能夠鑒定全基因組范圍的CRISPR/Cas9脫靶突變。

　　之前，在全基因組范圍鑒定脫靶效應的細胞方法也時有報道，但這些方法可能錯過低頻率的脫靶突變，而且高效轉染的要求也限制了其應用。相比之下，體外篩查策略則具有一定的優勢。它不需要高效轉染，避免了細胞適應性的影響。此外，活性核酸酶的濃度可以盡可能高，將低頻率突變一網打盡。

　　在這篇周一發表于《Nature Methods》的文章中，麻省總醫院和哈佛大學的研究人員介紹了一種新的體外篩查方法CIRCLE-seq。他們認為，這種方法在鑒定全基因組的CRISPR/Cas9脫靶突變上，比現有的細胞或生化方法表現更佳。

　　“與之前的體外方法相比，我們表明CIRCLE-seq可使用廣泛普及的新一代測序技術，且不需要參考基因組序列，”作者在文中寫道。重要的是，這種方法可以鑒定與細胞類型特異的單核苷酸多態性相關的脫靶突變，證明了它有望生成個性化的特異性圖譜。總之，CIRCLE-seq為鑒定全基因組范圍的脫靶突變提供了一種快速全面的方法。

　　在這項研究中，研究人員設計了不依賴限制性內切酶的策略，將隨機剪切的DNA轉化為兩種不同類型的共價閉合DNA結構：將莖環連接到線性DNA末端，或將線性片段環化。他們發現，在富集Cas9核酸酶切割的基因組DNA片段時，環化策略的效率比連接策略至少高了一個數量級。

　　隨后，研究人員檢測了新方法的靈敏度。他們獲得了針對HBB基因的向導RNA的脫靶結果，并將這個圖譜與另一種鑒定方法（Digenome-seq）獲得的圖譜進行比較。他們發現，CIRCLE-seq鑒定出Digenome-seq所發現的29個脫靶位點中的26個，同時還發現了156個新位點。

　　“這些結果表明，與Digenome-seq相比，CIRCLE-seq具有更高的信噪比，且需要的測序reads少了100倍。在鑒定全基因組的脫靶位點時，它有望實現更高的靈敏度，”作者寫道。

　　在同一期的雜志上，Caribou Biosciences和DuPont Pioneer的研究人員介紹了另一種名為SITE-Seq的生化方法，它利用通過向導RNA編程的Cas9來鑒定基因組內的切割位點