NatureMicrobiology：流感病毒聚合酶調控RNA合成機制

發布時間：2019-06-19 10:13 原文鏈接： NatureMicrobiology：流感病毒聚合酶調控RNA合成機制

　　流感病毒是危害全球公共衛生健康的重要病原之一，能在人群中引起大規模流行和季節性流感，每次暴發都會引起人類死亡并造成巨大的經濟損失。流感病毒（Influenza virus）是分節段的負鏈RNA病毒（Segmented Negative-Sense RNA virus, sNSV），屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），目前包括A，B，C和D四種類型。由于流感病毒易發生基因重配和抗原突變，現有疫苗無法提供持久性保護，再加上流感病毒的耐藥性問題出現得越來越頻繁，開發新型的抗病毒藥物已然迫在眉睫。流感病毒聚合酶對于病毒復制增殖和宿主適應都具有重要作用，并且在不同類型流感病毒中較為保守，是抗病毒藥物研發的重要靶點。因此對于流感病毒聚合酶工作機制的探索一直是研究熱點。

　　流感病毒聚合酶（Influenza virus polymerase，FluPol）由PA（在C型和D型流感病毒中為P3），PB1和PB2三個亞基組成，并以核糖核酸蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復合物形式來行使病毒基因組復制和轉錄雙功能。病毒基因組復制過程可以分為兩步：第一步通過結合保守的病毒RNA（viral RNA，vRNA）啟動子（promoter）從末端起始從頭合成互補RNA（complementary RNA，cRNA）；第二步通過結合保守的cRNA啟動子，從內部起始從頭合成病毒基因組RNA產物。病毒基因組轉錄過程則依賴宿主細胞的RNA PolII復合物，通過掠奪并利用宿主來源的加帽RNA（capped RNA）作為引物合成轉錄產物（messenger RNA，mRNA），從而啟動后續病毒蛋白的表達。病毒聚合酶合成RNA過程又可以進一步分為起始，延伸和終止三個階段。

　　過去五年里，前人通過晶體學技術成功解析了A，B和C型流感病毒聚合酶的結構，并對它們的復制和轉錄功能機制有了初步認識，但是關于D型流感病毒聚合酶的研究鮮有報道。同時流感病毒基因組的復制和轉錄過程是一個極為復雜的過程，除了聚合酶本身，還需要病毒RNA、其他病毒蛋白以及宿主因子的共同參與，才能高效準確地完成這個過程。目前對于這個復雜過程的認知尚有許多空白，亟需研究人員去填補。

　　為了系統比較不同類型流感病毒聚合酶結構和功能特征以及分析聚合酶在與不同RNA啟動子結合時的構象和工作機制，研究人員以D型流感病毒聚合酶為對象來展開研究。首先利用昆蟲細胞表達系統，成功純化得到高純度聚合酶蛋白并在體外證明其具有生理活性；然后利用冷凍電鏡三維重構技術解析了D型流感病毒聚合酶復合體的近原子分辨率三維結構。通過與A，B和C型流感病毒聚合酶的結構比較發現，它們都具有一個保守且構象穩定的核心區域，包括PA/P3亞基的C末端，PB1亞基和PB2亞基的N末端，以及柔性較大的外圍結構域，包括PA/P3亞基的內切酶結構域，PB2亞基的帽子結合域和核定位結構域等，提示不同類型的流感病毒聚合酶利用相似的機制合成RNA產物。

　　為了深入研究流感病毒聚合酶合成RNA的分子機制，研究人員利用冷凍電鏡三維重構技術，解析了D型流感病毒聚合酶與不同RNA啟動子結合的近原子分辨率三維結構。研究人員首次發現vRNA啟動子存在兩種不同的結合構象（3’-vRNA能夠結合在兩個不同的位置），分別定義為mode A和mode B，但是cRNA啟動子只采取mode B方式與聚合酶結合（圖1）。通過大量的細胞復制子和體外酶活功能實驗表明，病毒基因組復制第一步cRNA的合成主要通過mode A構象進行調控，而mode B構象主要在復制第二步聚合酶合成vRNA時發揮作用，并且這一過程需要其他病毒或宿主因子的參與。而病毒基因組轉錄過程同時受到兩種構象的調控。此外，mode A和mode B構象在轉運至酶活中心后會共用同一個催化前構象，并且這一構象與mode A的結合位點部分重合（圖2）。

　　值得思考的是，處于mode B構象的3’-RNA位于聚合酶的表面而未進入酶活中心，通過生物膜干涉實驗發現3’-RNA與聚合酶親和能力非常強，那么如何將處于mode B構象的3’-RNA轉運至酶活中心？研究人員通過動態光散射實驗分析不同狀態下D型聚合酶的聚體形式，結果顯示在加入啟動子后，聚合酶易于形成二聚體甚至寡聚體，并且cRNA啟動子更容易誘導這一過程。此前研究也曾報道過A型流感聚合酶能夠形成二聚體和四聚體。這些證據提示，不同聚合酶間的相互作用可能誘導其構象變化，從而促進處于mode B構象的3’-RNA轉運至酶活中心，但其分子機制還需進一步驗證和探索。

　　此項工作首次系統性地研究了流感病毒聚合酶與不同RNA啟動子的相互作用機制，闡明了RNA啟動子結合構象在合成不同RNA時所發揮的作用，并提出了聚合酶合成RNA起始階段的工作模型，推動了人們對流感病毒聚合酶調控不同RNA合成機制的理解，為抗病毒藥物開發提供了新靶點。

　　該研究成果已在線發表在Nature Microbiology雜志上，題為Structural insight into RNA synthesis by influenza D polymerase。中國科學院微生物研究所施一研究組的博士生彭齊、聯合培養碩士生劉雨騫和助理研究員彭如超為論文并列第一作者；施一研究員和高福院士為論文共同通訊作者。該研究得到了中國醫學科學院病原生物所鄧濤研究員，中國科學院生物物理所章新政研究員，南方科技大學冷凍電鏡中心王培毅教授，中國科學院微生物所齊建勛和嚴景華研究員等老師的大力支持，并得到了中國科學院戰略先導B專項，國家科技重大專項，中國科學院國際合作重大項目，國家自然科學基金委優秀青年科學基金和中國科學院青年創新促進會等項目支持。