NgAgo基因編輯技術之初體驗

　　在CRISPR/Cas9之后，DNA指導的核酸內切酶NgAgo又登上基因組編輯的舞臺。幾個月來，NgAgo經歷了大起大落，一開始備受矚目，最近又備受質疑。英國醫學研究理事會（MRC）再生醫學中心的Pooran Dewari近日調查了NgAgo技術的使用情況。他認為，這種技術還需要更多時間的優化和發展，才能真正與CRISPR正面交鋒。

　　NgAgo的獨特之處

　　Dewari首先介紹了NgAgo為何引人注目。首先，與Cas9不同，NgAgo不需要PAM序列來識別目標，這讓研究人員有了前所未有的自由，去靶定DNA中的任何序列。其次，NgAgo的特異性是由DNA指導序列決定的，而不是RNA向導。第三，它能夠靶定困難的富含GC區域，這些區域似乎耐受Cas9的切割。

　　當然，CRISPR/Cas9和NgAgo基因組編輯方法都有自己的優點和缺點。NgAgo DNA向導比較便宜，可自行開展5’-磷酸化或從市場上購買。不過，與RNA向導不同，它不能從質粒中產生。此外，NgAgo/ssDNA的體外組裝需要在55°C孵育，這個溫度對哺乳動物細胞很危險。在體內，只有新生的NgAgo蛋白可以與ssDNA向導形成復合物。因此，研究人員必須將5’-P-ssDNA向導與NgAgo表達質粒共轉染，才能在體內編輯基因。

　　NgAgo的真實體驗

　　自今年5月首次發表以來，NgAgo技術一直備受關注，而質粒也被全世界的實驗室索要了400多次。研究人員都在興奮地試驗NgAgo的基因組編輯應用。他們的進展如何呢？Dewari登陸了NgAgo的谷歌論壇，發現許多研究人員都難以形成插入缺失。于是，他進行了一項調查，詢問他們的實驗情況，以及與CRISPR/Cas9的比較。

　　截至2016年8月1日，總共165名研究人員答完了調查問卷。當被問及他們是否能用NgAgo形成插入缺失時，在88名受訪者中只有1人證實，在目標位點成功形成了插入缺失。同時，41名受訪者試圖利用此技術進行表位標記，但只有1人能夠在目標位點檢測到標記的插入（knock-in）。總的來說，64%的研究人員對新方法不滿意，65%的人希望有人能優化NgAgo的操作。絕大多數的受訪者（70%）是利用Lipofectamine方法將NgAgo導入細胞的，與最初的文章相同。

　　Dewari認為，盡管大多數受訪者都在努力掙扎著，但這并不意味著NgAgo沒有作用。從好的方面來看，少數受訪者的確實現了成功的插入缺失和表位插入，這表明NgAgo能在哺乳動物細胞中實現基因組編輯。

　　然而，大多數研究人員的現狀表明，NgAgo系統可能不容易上手。原因之一是所謂的5’-磷酸化ssDNA向導的不穩定性，它可能被細胞機制迅速降解，使得細胞中只有少量的NgAgo/ssDNA復合物。正如原文所提到的，為了實現更好的效果，研究人員需要將ssDNA反復轉染。另一個可能的原因是成熟的NgAgo蛋白無法結合ssDNA向導。在翻譯過程中，也許只有小部分的新生NgAgo蛋白能夠與ssDNA形成有功能的復合物，導致下游的編輯效率不高。

　　總的來說，Dewari認為我們還需要更多的時間來優化NgAgo，才能得出任何主要結論。他建議從事相關工作的研究人員在谷歌論壇、Twitter或Addgene的博客上討論，將研究成果與大家分享。基因組編輯領域一直在飛速發展，說不定哪天就有人開發出NgAgo的突變蛋白或全新的核酸內切酶。