Nicoya OpenSPR 在酶類研究中的創新應用------β羧化β-碳酸酐酶結構對γ-碳酸酐酶結合的影響
碳酸酐酶CcaA是藍藻細菌羧酶體的組成成分。CcaA含有特征性的未知功能的C末端延伸，通過與γ-碳酸酐酶（CcmM）的相互作用被整合到羧酶體上，在很多藍藻細菌中CcmM是具有酶活性的碳酸酐酶的同源體。我們已經從集胞藻屬中確定了CcaA的結構。與大多數細菌碳酸酐酶的二聚體結構或者植物酶中丟失的二聚體結構不同，CcaA展現很好的三聚體結構。
為了探索碳酸酐酶CcaA與γ-碳酸酐酶（CcmM）相互作用機制，2017年圭爾夫大學分子與細胞生物學系的Matthew S. Kimber團隊在《BIOCHEMICAL JOURNAL》發表了他們的研究成果，研究發現CcaA / CcmM復合物的形成可能需要至少在一個結合配對區移動的重要支柱。表面等離子共振技術表明CcaA與CcmM以亞皮摩爾的親和力，通過CcmM's αA的螺旋區和CcaA's的C末端尾部形成復合物。催化特征表明，相對γ-碳酸酐酶CcmM，CcaA是至今為止最不活躍的β碳酸酐酶，其即可補充也可被替代。有趣的是，C末端尾部顯示出部分的抑制活性，可能會減少未封裝的酶的活性。
為了進一步研究CcaA / CcmM復合體形成機制，本次實驗首先設計引物擴增CcaA274和CcaA220基因，之后插入PET 載體表達，之后通過加拿大Nicoya公司的OpenSPR儀器（LSPR技術）檢測蛋白與蛋白的親和力。為突出CcaA 的C末端尾部的作用，實驗過程檢測了CcaA274和CcaA220與CcmM206的結合情況，并以前兩者作為配體固定到COOH芯片上，用標準的EDC和NHS激活芯片，CcaA濃度范圍為15-50μg/mL，運行速度20μL/min，分析物濃度（CcmM206或CcmM206-4A; 0.12-29.9μg/mL)，運行速度20-150μL/min；同時還調查了CcaA結構對CcmM206-4A（含Q159A/H161A/D168A/Q170A四個氨基酸的突變體）的結合影響，結果用TraceDrawer 軟件分析，獲取的 CcaA與CcmM的動力學結果如下表：
表1：CcaA與CcmM的結合常數，解離常數，親和常數
表1：CcaA與CcmM的結合常數，解離常數，親和常數
LSPR檢測結果顯示：CcaA274對CcmM206-4A 結構的親和力降低了9倍，表明CcmM αA周圍的冗余側鏈通過CcmM在調節CcaA結合中起重要的作用，盡管這些單獨的側鏈不是必須的，并且CcaA220與CcmM206-4A的結構結合也變弱，而CcaA274與CcmM206的相互作用力很強。證明了CcmM-4A的結構對親和力有很明顯的影響作用。同時也證實CcmM的C末端β螺旋可能對相互作用起決定性作用。整個實驗過程操作簡單，檢測速度非常快，獲取的動力參數，科學客觀的數據透徹的解析了CcmM末端β螺旋在與CcaA相互作用中的決定性作用。
Nicoya OpenSPR個人型分子互作儀優勢：
? 操作簡單---半個小時即可掌控
? 高檢測效率---15-30min出結果
? 實驗成本低---低成本儀器及芯片
? 低背景干擾--檢測不受溫度、緩沖液折射率影響
? 無需專門的校正通道---可忽略的bulk效應