Nif對白皮松花粉管細胞壁構建的影響

實驗概要

本實驗研究了鈣通道抑制劑Nif處理對花粉管細胞壁主要成分的分布及含量的影響。

主要試劑

1. 0.1%無色水溶性苯胺藍：0.1 g水溶性苯胺藍，用0.15 M K₂HPO₄(pH 8.2)溶解。新配制的溶液有色，堿性條件下經過數小時變成脫色溶液即可使用。

2. Calcofluor (fluorescent brightener 28，Sigma F-3543，UK)用雙蒸水溶解，終濃度為10 mg/ml，10000g離心，4℃避光保存備用。

3. 100 mM PBS緩沖掖：分別稱取NaCl 8.0 g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KH₂PO₄ 0.2 g，依次溶解于800 ml雙蒸水中，用1 N HCl調pH 7.2，定容至1000 ml。

4. PME緩沖液：100 mM PIPES，1 mM MgCl₂，2 mM EGTA，pH 6.8：分別稱取PIPES 3.02 g，EGTA 0.076 g，MgCl₂ 0.0204 g，用雙蒸水溶解，調pH 6.8，加雙蒸水定容至100 ml。

5. 3%多聚甲醛固定液：3 g多聚甲醛，加入50 ml雙蒸水，50-60℃下加熱 30 min，用少量1 N NaOH調pH 6.9，攪拌溶解。然后加入上述PME緩沖液(pH 6.8)，定容至100 ml。

6. 抗體：JIM5(識別酸性果膠質，Acidic  pectins)、JIM7(識別甲酯化果膠質，Esterified　pectins)、LM2(識別阿拉伯半乳聚糖蛋白)、LM6(識別阿拉伯半乳聚糖蛋白)單克隆抗體購自University  of Leeds, UK；JIM13(識別阿拉伯半乳聚糖蛋白)。結合FITC的羊抗大鼠IgG抗血清(fluorescein  isothiocyanate-labeled sheep anti-rat IgG  antiserum)購于Sigma。抗體均在-20℃下避光保存，使用時用pH 7.2的PBS稀釋10倍。

7. 蛋白提取液：65mM Tris (pH 6.8)，1% SDS，5% 甘油，2.5% β-巰基乙醇和0.01%溴酚蘭。

主要設備

熒光顯微鏡(Axioskop 40，Zeiss，Germany)

Spot П 照相機(Diagnostic Instruments Inc.)

實驗材料

白皮松花粉

實驗步驟

1. 材料培養

分別稱取10mg白皮松花粉，置于以下兩種培養基，25℃條件下搖床(120rpm)暗中培養72h。培養基中所含DMSO濃度低于1%，該濃度對于花粉萌發和花粉管生長無影響。

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 250μM /500μM Nif

2. 花粉管細胞壁中纖維素的標記

將Calcofluor溶液于14000g離心5min，取上清液與培養液按1：10混勻，暗中孵育45min，熒光顯微鏡下觀察，數字圖像用Spot П 照相機采集，并在明場下采集黑白圖像。

3. 花粉管細胞壁中胼胝質的標記

1) 取材：不同處理培養84 h的花粉管用3%多聚甲醛固定液沖洗過濾；

2) 在含3%多聚甲醛(paraformaldehyde)的PME固定液中真空抽氣5-10 min，室溫下固定1 h；

3) 去掉固定液，100 mM PBS緩沖液(pH 7.2)洗3次，每次10 min；

4) 樣品與0.1%無色水溶性苯胺藍(aniline blue)室溫下孵育5-10 min；對照：樣品與100 mM PBS 緩沖液孵育；

5) 0.5%甲苯胺蘭(toluidine blue O)(用1 mM PBS配制，pH 7.0)處理10 min，消除非特異性染色；

6) 將材料裝載于載玻片上，并滴加0.2% 的抗熒光淬滅劑；

7) 在裝有365-400λ濾光片的紫外光學顯微鏡下觀察、拍照。

多聚甲醛可以快速地固定花粉管細胞壁成分，并能良好地保持花粉管形態。為檢驗多聚甲醛對標記造成的可能假像(artefact)，另設不固定的花粉管作為對照。兩種操作都將胼胝質標記在細胞壁相同的位置上，并且熒光強度沒有明顯差別，說明多聚甲醛固定材料在本實驗中沒有產生假象。

4. 花粉管細胞壁中果膠質免疫熒光標記

1) 不同處理培養84 h的花粉管用3%多聚甲醛固定液沖洗過濾；

2) 在含3%多聚甲醛的PME固定液中真空抽氣5-10 min，室溫下固定1 h；

3) 去掉固定液，100 mM PBS緩沖液(pH 7.2)洗3次，每次10 min；

4) 單克隆抗體JIM5和JIM7均用100 mM PBS以1：5的比例稀釋，室溫下與樣品避光孵育2.5 h；

5) 100 mM PBS洗3次，每次10 min；

6) 與結合FITC的二抗(1：100稀釋于PBS中)在室溫下避光孵育2 h；

7) 100 mM PBS洗3次，每次10 min；

8) 裝載于載玻片上，并滴加0.2% 的抗熒光淬滅劑；

9) 激光共聚焦掃描顯微鏡(BIO-RAD， USA，MRC1024，Kr/Ar 激光，激發波長488nm，發射波長522nm)下觀察并采集圖像，同時，于光纖二通道下采集明場圖片。

對照1：用100 mM PBS代替一抗JIM5或JIM7；

對照2：用100 mM PBS代替二抗FITC-IgG，按上述操作同時進行。

5. 傅里葉顯微紅外光譜分析(Fourier Transform Infrared spectroscopy，FTIR)

1) 不同處理培養84 h的花粉管用去離子水充分沖洗；

2) 樣品-20℃貯存待測或立即進行下面的操作；

3) 樣品置于BaF2晶片(Barium fluoride window)上，50℃下充分干燥30 min，烘干水分；

4) 在裝有MCT檢測器及顯微鏡的Perkin-Elmer Cetus MAGNA 750 FTIR 光譜儀(Nicolet Corp., Tokyo, Japan)記錄FTIR光譜，光譜分辨率8 cm^-1，測量范圍2000-800 cm^-1，掃描次數128次；

5) 取適宜吸收波數(wave numbers cm^-1)用Excel 作圖并分析，y軸數據設為相對吸光度(Absorbance)。

6. 阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan-proteins, AGPs)免疫熒光標記

一抗為單克隆抗體LM2、LM6和JIM13，其余按與果膠質免疫熒光標記相同的步驟操作。

7. 細胞壁蛋白的凝膠電泳分析

1) 收集白皮松花粉粒及不同處理培養84 h的花粉管，液氮研磨；

2) 加入預冷的50 mM磷酸緩沖液 (pH 6.0)，0℃下10000g離心15min，收集沉淀；

3) 用預冷的50 mM磷酸緩沖液沖洗沉淀物；

4) 用預冷的重蒸水沖洗沉淀物，0℃下500g離心5min，收集沉淀，重復8次；

5) 用預冷的1% Triton X-100沖洗沉淀物，0℃下500g離心5min，收集沉淀，重復2次；

6) 用預冷的重蒸水沖洗沉淀物，0℃下500g離心5min，收集沉淀，重復8次；

7) 加入預冷的1M NaCl溶液，在4℃下放置2h，中間搖動數次，0℃下12000g離心10min，收集上清液；重復2－3次，合并上清液，裝入透析袋；

8) 用500 ml預冷的50 mM磷酸緩沖液 (pH 6.8)透析48h，中間換兩次緩沖液；

9) 用200 ml 10% PEG20000(溶解于50 mM磷酸緩沖液，pH 6.8)濃縮24h；

10) 用預冷的50 mM磷酸緩沖液 (pH 6.8)將樣品從透析袋中洗出，離心，收集上清液，分裝備用。

11) 蛋白質濃度用Bradford法測定。

    12) SDS-PAGE采用12%凝膠，凝膠厚度為1.0mm，緩沖系統參照Laemmli，銀染。