Nif對白皮松花粉萌發和花粉管生長的調節

實驗概要

本研究以白皮松花粉為實驗材料，用不同濃度鈣通道抑制劑Nif處理花粉和花粉管，結合Fluo-3AM熒光標記探討Ca² 在白皮松花粉萌發和花粉管生長過程中的作用。此外運用Ca² 螯合劑及外加鈣調素研究Ca² 包括細胞壁鈣庫對白皮松花粉萌發和花粉管生長作用。

主要試劑

1. 蔗糖、CaCl₂和硼酸均用雙蒸水溶解，然后按所需濃度配制。

2. Nif購自Sigma，用無水DMSO溶解，配成10^-3mol/L的貯存液。

3. Fluo-3AM: Molecular Probes產品，用無水DMSO溶解配成10^-3mol/L溶液，于-20℃下保存。

4. 鈣調素(CaM)購自Sigma，溶解配成7.5×10^-5mol/L貯存液。

5. 多聚賴氨酸(Poly-L-Lys MW>300kD，Sigma)。

主要設備

激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，Meta550)

光學顯微鏡(Olympus)

實驗材料

白皮松花粉。采集白皮松散粉之前的成熟小孢子葉球(雄球果)，置于室溫下干燥48h，待散粉后，用無菌干燥小瓶收集成熟花粉，并密封保存于-20℃備用。

實驗步驟

1. 配制含不同濃度Nif的培養基

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1μM Nif

3) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 10μM Nif

4) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 100μM Nif

5) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1mM Nif

6) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 2.5mM Nif

7) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 5mM Nif

稱取花粉10mg，在室溫下平衡30min，懸浮于10ml培養基中，25℃條件下搖床(120rpm)暗中培養。培養基中所含DMSO濃度低于1%，該濃度對于花粉萌發和花粉管生長無影響。

2. 外源細胞壁Ca² 及鈣調素的作用

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1 mM EGTA

3) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1 mM EGTA漂洗白皮花粉10min，然后轉移到CKM

4) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 1 mM EGTA漂洗白皮花粉10min，然后轉移到CKM 0.1μM CaM

3. 花粉萌發率和花粉管生長速度的測定

萌發率的測定：花粉培養36h后萌發，每隔12h統計花粉的萌發率。當花粉管的長度大于花粉粒的直徑時，花粉粒被認為萌發。在光學顯微鏡下統計出萌發和未萌發的花粉粒數，根據公式：萌發率＝萌發的花粉數/總的花粉數×100%計算出萌發率。每個實驗重復三次，每次所統計的花粉粒數目不少于300粒。

花粉管生長速率的測定：體外培養36h后，每隔12h取少量樣品，用含有與培養基等濃度的蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30min。在光學顯微鏡下(Olympus)上選取已萌發的花粉進行測量。每個樣品至少測定200個花粉管，計算出平均長度和標準差。用F檢驗和t檢驗分析處理與對照的差異顯著性程度。

4. Fluo-3AM低溫裝載

        不同培養基中培養的花粉，加入1mM  Fluo-3至終濃度為10μM，混勻后放于4℃冰箱中輕微振蕩2h后取出，用CKM離心洗滌3次，室溫靜置1h。將裝載了Fluo-3AM的樣品用多聚賴氨酸粘附在載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下用488nm對樣品進行掃描，記錄花粉管細胞質中Ca² 的分布情況。每個實驗重復三次。