實驗概要
本實驗介紹了Northern雜交的基本流程。
主要試劑
液氮，TRIzol (Invitrogen)，DEPC水，氯仿，異丙醇，70%酒精，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，水飽和酚(PH4.3)，無水乙醇，NaOAc，抽提緩沖液(0.02M NaOAc，1 mM EDTA，0.5% SDS)，RNase-free DNase，上樣緩沖液(500ul formamide，100ul 10X MOPS，170ul formaldehyde，5ul ethydium bromide)，瓊脂糖，10 X MOPS緩沖液(200 mM MOPS，20 mMNaOAc，10 mM EDTA)，雜交緩沖液(200mM磷酸鈉緩沖液，PH7.2，1 mM EDTA，50%甲酞胺，1% BSA，7% SDS)，機引物標記試劑盒，洗脫緩沖液(2 X SSC，0.5%SDS)
主要設備
研缽，高速離心機，搖床，水浴鍋，電泳儀，電泳槽，Phosphorlmager，硝酸纖維素膜和兩張Whatman濾紙，轉移裝置，紫外膠聯儀，雜交瓶
實驗材料
植物葉片，細菌
實驗步驟
1. 植物RNA提取
1) 取5-6片植物葉片液氮速凍，研磨成細小粉末。
2) 加入1mL提取緩沖液TRIzol (Invitrogen)研磨直至均勻，于室溫孵育5分鐘。
3) 加入200ul氯仿抽提2-3分鐘，12000g于4℃離心10分鐘。
4) 將上清轉移至新管，加入500ul異丙醇于室溫孵育10分鐘，12000g于4℃離心10分鐘。
5) 棄上清，加入1mL 70%酒精洗滌。
6) 短離心去除酒精，晾干后加入適量DEPC水溶解。
2. 細菌RNA提取
1) 接種單克隆于2mL含相應抗生素的液體培養液中，28℃搖床培養過夜。
2) 12000rpm離心30秒收集菌體。
3) 棄上清，加入0.4mL 60℃預熱的水飽和酚(PH4.3)，劇烈震蕩至細菌完全懸浮。
4) 加入0.4mL 60℃預熱的抽提緩沖液(0.02M NaOAc，1 mM EDTA，0.5% SDS)，劇烈震蕩。
5) 60℃水浴5-10分鐘后轉移至冰上冷卻。
6) 12000rpm離心5分鐘，取上清。
7) 加入0.4mL 60℃預熱的水飽和酚(PH4.3)，劇烈震蕩后轉移至冰上冷卻，于4℃12000rpm離心10分鐘。
8) 重復步驟7)。
9) 取上清，加入0.4mL酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，劇烈震蕩后于4℃ 12000rpm離心。
10) 加入2.5倍體積無水乙醇和0.1體積NaOAc混勻后-20℃沉淀1小時。
11) 12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1mL 70%酒精洗滌。
12) 短離心去除酒精，晾干后加入400ulDEPC水溶解。
13) 加入1ul RNase-free DNase，37℃孵育1小時。
14) 加入0.4mL酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。
15) 按照步驟10)和11)沉淀RNA。
16) 短離心去除酒精，晾干后加入50ulDEPC水溶解。
3. Northern雜交
1 ) 稱取2g瓊脂糖，加入140mL水煮沸直至瓊脂糖完全溶解。
2) 等到瓊脂糖稍冷卻后加入20mL 10 X MOPS緩沖液(200 mM MOPS，20 mMNaOAc，10 mM EDTA)和40mL甲醛，混勻后灌制甲醛變性膠，浸泡于1 X MOPS緩沖液中。
3) 取10ug RNA與3倍體積的上樣緩沖液(500ul formamide，100ul 10X MOPS，170ul formaldehyde，5ul ethydium bromide)混勻，65℃加熱15分鐘，迅速置于冰上冷卻。
4) 上樣后120伏電壓電泳約3小時。
5) 電泳結束后，用去離子水漂洗RNA膠，并照相。
6) 搭建轉移裝置，并裝入10 X SSC。
7) 切一張與RNA膠相同大小的硝酸纖維素膜和兩張Whatman濾紙，并在膜左上角標記，先后用去離子水和10 X SSC漂洗。
8) 按順序先后將RNA膠和硝酸纖維素膜鋪在轉移裝置上，并用保鮮膜封邊。再鋪上兩張Whatman濾紙，用500g重物壓實，轉移過夜。
9) 去掉Whatman濾紙，在硝酸纖維素膜上標記加樣孔的位置，用2XSSC漂洗后晾干。
10) 用紫外膠聯儀將RNA膠聯到硝酸纖維素膜。
11) 配制雜交緩沖液(200mM磷酸鈉緩沖液，PH7.2，1 mM EDTA，50%甲酞胺，1% BSA，7% SDS)。
12) 將膜放進雜交瓶，RNA而朝向空氣。
13) 加入1 5mL雜交緩沖液，于42℃預雜交2-3小時。
14) 用隨機引物標記試劑盒(Ambion)方法制備探針，變性后加入雜交瓶，雜交16-20小時。
15) 去掉雜交液，用預熱至40-50℃的洗脫緩沖液(2 X SSC，0.5%SDS)洗兩次，每次5-10分鐘。
16) 用預熱至40-50℃的洗脫緩沖液(1X SSC，0.5%SDS)洗兩次，每次5-10分鐘。
17) 用預熱至40-50℃的洗脫緩沖液(0.5X SSC，0.5%SDS)洗兩次，每次5-10分鐘。
18) 取出膜后晾干儲存于Phosphorlmager。
19) 24小時后放射自顯影。