實驗概要
Omega質粒大量提取試劑盒中文說明書(E.Z.N.A. EndoFree Plasmid Maxi Kit I)。
主要試劑
1. 使用前，將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。
D6926-00B: 加入60ml無水乙醇
D6926-01B: 加入160ml無水乙醇
D6926-03B: 加入200ml無水乙醇
D6926-04B: 每瓶中加入200ml無水乙醇
實驗步驟
1. 取100- 200ml 菌液3,500-5,000 x g室溫離心10min收集菌體沉淀；
2. 小心去除上清液，加10 ml Solution Ⅰ/ RNase A，渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體；
3. 加10 ml SolutionⅡ，來回顛倒10- 15次輕柔混勻，得到澄清的裂解液。
4. 加5 ml Buffer N3，顛倒混勻幾次直至出現白色絮狀沉淀，室溫放置2-3min讓其充分反應。
5. 準備結合柱——加5ml的Buffer GPS至結合柱中，室溫放置3-10min，3,000-5，000×g離心5min，棄濾液，往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液后，把柱子插入50ml收集管中。
6. 把第4步中獲得的溶液及沉淀物全部轉移至針筒式過濾器中，室溫放置2min后推壓過濾器，用一個新的50ml離心管收集濾出的清液(此步可用“15,000×g 4℃離心10min得上清”代替)。
7. 第6步獲得上清液后,加入與上清等體積的ETR Binding Buffer，顛倒混勻7-10次。
8. 結合質粒——把準備好的結合柱插入50ml收集管，小心轉移混合液至結合柱柱里，3,000-5,000×g離心3-5min，棄濾液。
9. 重復第8步，直至所有上清都過濾完，棄濾液。
10.加入10ml ETR Wash Buffer到結合柱上，3,000-5,000×g離心3-5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液。
11. 加入10 ml Buffer EHB到結合柱上，3,000-5,000×g離心3-5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
12. 加入15 ml DNA Wash Buffer到結合柱上3,000-5,000×g離心3-5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
注意：濃縮的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用無水乙醇稀釋。
13. 加入10ml DNA Wash Buffer到結合柱上3,000-5,000×g離心3-5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
14. 把空柱子套回離心管，最大轉速(不超過6, 000×g)離心10-15min干燥柱子；
15. 進一步干燥柱子——把柱子轉移真空抽濾裝置上抽濾10min或把柱子放入65℃恒溫箱10-15min；
16. 把結合柱套在一個新的50ml離心管中，加入1-3ml Endotoxin-Free Elution Buffer，室溫放置2-5min，最高轉速離心5min洗脫質粒DNA。
備注：第一次洗脫可洗脫出60-80%結合在膜上的DNA，進行二次洗脫可洗脫出更多的DNA，提高DNA產量，但同時濃度會降低；使用預熱到70℃的洗脫液可提高洗脫效率。
如需濃縮質粒DNA可參照以下操作：
1. 按常規操作到第15步結束后，把結合柱套在一個新的50ml離心管中，加入6ml預熱到70℃的Endotoxin-Free Elution Buffer(或無菌水)，室溫放置2—5min，最高轉速(不超過6, 000×g)離心5min洗脫質粒DNA；
2. 小心轉移洗脫產物至一個干凈的容器中進行沉淀，加入260 ul 5M NaCl和4.4ml 室溫異丙醇，渦旋混勻后15,000×g，4℃離心30min，收集質粒DNA沉淀，小心去除上清；
3. 加入2ml 70%乙醇輕柔吸打洗滌質粒DNA沉淀后，15,000×g，離心10min,小心倒掉上清。空氣干燥5—10min至乙醇完全去除(如10min后仍有乙醇氣味殘留，可增加干燥時間)；
4. 用200—500ul Endotoxin-Free Eluiton Buffer或無菌水(洗脫體積取決于下游實驗所需質粒濃度)溶解DNA。