OsAGAP的Northern雜交

實驗概要

本實驗參照Sambrook等(1989)的方法進行轉膜，雜交。

實驗步驟

1. RNA樣品的電泳轉膜

將適量的瓊脂糖溶于水，微波爐加熱使之完全溶解，并冷卻至60℃；將甲醛溶液、瓊脂糖水溶液、5X甲醛凝膠電泳緩沖液按1:3.5:1.1比例混合，灌制凝膠。將不同材料的上樣量調成一致，均為35ug，與樣品buffer混合制樣，65℃溫育15min，冰浴冷卻后，加入loading buffer上樣。DEPC水浸泡過的電泳槽中，加入1X甲醛凝膠電泳緩沖液((5X甲醛凝膠電泳緩沖液：MOPS 10.3g；乙酸鈉2.72g；EDTA(0.5M pH8.0)5ml；ddH₂O加至500mI；pH 7.0)，3-4v/cm電泳。待溴酚藍遷移至凝膠的2/3處，停止電泳。

將凝膠轉移至一個培養皿內，切去凝膠左上角以作標記；將凝膠用滅菌的DEPC水淋洗3-4次，然后浸泡于數倍體積的20 X SSC溫和搖動45min；利用毛細作用轉膜(轉移緩沖液為20XSSC)，轉移18小時；120℃烤膜30分鐘。

樣品buffer：5 X甲醛凝膠電泳緩沖液2.0ul；甲醛3.5ul；甲酰10.0ul

10 X loading buffer：0.5M EDTA (pH8.0) 2ul；甘油500ul；溴酚藍250mg；二甲苯青FF 250mg；ddH₂O加至lml。

2. 雜交、壓片

放射性藥品操作完全按照放射安全防護守則進行。

將結合有RNA的尼龍膜先用6 X SSC完全浸濕，然后再放入雜交管中，加入適量預雜液，65℃預雜交2-3hr；標記好的探針，利用PCR產物純化試劑盒(QIAGEN )加以純化，100℃煮沸變性，l0min；預雜交結束后，加入適量雜交液和純化的、變性的探針，65℃雜交過夜(17小時以上)；用不同濃度的洗脫液65℃洗脫，一般先用低嚴謹洗脫液，再用高嚴謹洗脫液，根據實際情況確定洗脫時間。其間，用放射性檢測儀檢查硝酸纖維素膜上放射性雜交信號的強弱。用保鮮膜包裹尼龍膜后，在暗室中，用X-光膠片進行放射自顯影；-80℃曝光3-7天后，按常規洗片。

預雜液：20 X SSC 15ml；50 X denhardt 5ml；10%CDS 2.5ml；鮭精DNA (Sigma) (l0mg/ml) 0.5mI；ddH₂O 27ml

雜交液：20X SSC15ml；10%SDS 2.5ml；鮭精DNA(Sigma) (l0mg/ml) 0.5mI；ddH₂O 32ml

洗脫液：2 X SSC加0.1%SDS；1 X SSC加0.1%SDS；0.1 X SSC加0.1%SDS