PAT法分析mRNAPoly（A）尾長度實驗

T4 DNA連接酶無 RNase H SuperscriptⅡ反轉錄酶寡聚(dT)錨引物mRNA特異引物

蒸餾水Superscript Ⅱ RT緩沖液DTTATPdNTPTaq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶緩沖液

一、材料與設備

1. PAT cDNA 制備

(1) DEPC 處理蒸餾水。

(2) 高濃度T4 DNA 連接酶（10 Weiss U/L）。

(3) 無 RNase H Superscript Ⅱ 反轉錄酶（RT) ( Life Technologies，Gairhersburg，MD，USA ) ( 200 U/μl )。

(4) 5 X Superscript Ⅱ RT 緩沖液。

(5) 0.1 mol/L DTT，DEPC 水配制。

(6) 10 mmol/L ATP，DEPC 水配制。

(7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPO-H₂O 配制。

(8) p[dT]_12-18注意寡[dT]_12-18必須被磷酸化 ]，10 ng/μl。

(9) 寡聚（dT ) 錨引物（5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T₁₂）200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸（n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作為 PCR 引物），DEPC 水配制，所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。

2. PCR 反應

(1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPC 水配制。

(2) 寡聚（dT ) 錨引物 200 ng/μl 水配制。

(3) mRNA 特異引物，溶于蒸餾水。

(4) Taq DNA 聚合酶。

(5) 10X Taq DNA 聚合酶緩沖液。

二、操作方法

1. PAT cDNA 制備

(1) 從組織或細胞中提取總 RNA 溶于 DEPC 水中，取 5 μl 加入無 RNase 的微量離心管中。

(2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]_12-18 至每個 RNA 樣品中，RNA 和 p[dT]_12-18 的總體積為 7 μl。

(3) 加熱到 65℃，變性 5~10 min。

(4) 立即將反應管置于 42°C 水浴中，注意動作要迅速，以避免 p[dT]_12-18 與最未端 poly(A) 尾退火。

(5) 加入 13 μl 預熱至 42°C 的 下列混合物，用吸頭吹打混勻，置 42℃ 孵育 30 min。對于所有 PAT 反應，預先混合所有相同組分，對于每一個反應，應加入：4 μl 5X Superscript II RT 緩沖液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物，1 μl 10 mmol/L ATP， 4 μl DEPC 處理水，1 μl T4 DNA 連接酶 10 Weiss U/μl。

(6) 孵育后，反成物仍保溫于 42℃ ，加入 1 μl (200 ng ) 寡聚（dT) 錨引物。混勻，快速離心，12℃ 孵育 2 h。

(7) 將反應管置于 42℃ 孵育 2min。

(8) 加入 1 μl 無 RNase H Superscript II 反轉錄酶，混勻，置于 42°C 孵育 1 h。

(9) 加熱 20 min，使反轉錄酶和連接酶失活，PAT cDNA 可根據需要進行稀釋。

2. PCR 反應

(1) 25~50 μl 標準反應體系包括：1X 緩沖液 [ 50 mmol/L KCl，10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 時 pH 9.0 )，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl₂ ]，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 模板特異引物，0.5 μmol/L 寡聚（dT) 錨引物，0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶， 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作為模板。

(2) 擴增 500 bp 長片段建議使用的循環條件：93°C 變性 5 min，93°C 變件 30 s，57~65°C 復性 1 min，72℃ 延伸 1 min，最后 72°C 延伸 7 min。

(3) 可以取一小部分擴增產物，利用限制性內切核酸酶完全消化分析 3' 末端。

(4) 用凝膠電泳分析擴增產物。