【注意事項】
1. PCR引物設計：
引物設計可能是PCR擴增成功最關鍵的因素。如引物設計欠佳，可能導致擴增產物不足，甚至擴增失敗，其原因是設計欠佳的引物可導致非特異擴增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應的競爭性產物，從而進一步抑制PCR產物形成。
在引物設計時必須考慮以下幾個因素，其中最重要的是引物長度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補問題、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。
（1）引物長度：由于PCR反應的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關聯，因此引物長度是PCR擴增是否成功關鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。
（2）溶解溫度(Tm)：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變為單鏈DNA的溫度。Tm可采用下列公式計算：Tm＝2(A+T) + 4(G+C)。
需注意PCR反應至少有兩個（一對）引物，兩個寡核苷酸引物Tm 值應比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應溫度時可發生錯配，而引物Tm值較低，反應溫度較高時則可能不能發生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。
（3）引物序列互補：設計引物時應絕對沒有3個堿基以上的內引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區域，“彈回”即部分雙鏈結構將發生在退火反應時。
（4）G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸：待選擇的引物序列應盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45％-55％。在選擇的引物序列中應沒有多G 或多C延伸，因其可促進非特異性退火，多A 和多T延伸也應避免，因其可“呼吸”和使引物－模板復合物展開延伸，降低擴增的效率。同時多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應被避免。
（5）3’-末端序列：為控制引物錯配，應認真地確定PCR引物中3’末端的位置。
總而言之，應重視PCR引物設計，設計PCR引物時應認真小心。對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3’序列必須優化。理想的引物應為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50％、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點時，應考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級結構形成的傾向，不自我互補，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設計，節省時間，減少錯誤，可應用計算機程序優化設計、選擇、確定寡核苷酸引物。
最常用的引物設計軟件和網站是：http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/ primer3_www.cgi
2. 模板DNA：
溶解模板DNA于含有低濃度的EDTA（<0.1 mM）的10mM Tris-Cl（pH 7.6）中。DNA的濃度分別為：哺乳動物基因組（100 μg/ml），酵母基因組DNA（1 μg/ml），細菌基因組DNA（0.1 μg/ml），質粒DNA（1-5 μg/ml）。
3. 防止污染：由于PCR能夠使單個DNA分子得以擴增，所以應當注意防止反應體系被痕量DNA模板污染，尤其是在待擴增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。
（1）如有可能，應在裝有紫外燈的層流式工作臺內吸加PCR試劑和進行反應。凡不用工作臺時應打開紫外燈。應使工作臺內始終置有PCR專用的微量離心機、一次性手套、整套移液器和其他必需品。由于自動移液器的管部是常見的污染源，因此配液和移液時應當使用配有一次性吸頭和活塞的正向排液式移液器。準備一套特殊的試劑和溶液專用于PCR。所有的玻璃器皿于150oC下烘烤6小時，所有塑料器皿、緩沖液、吸頭和離心管使用前必須經過高壓處理。
（2）一旦進入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應戴上一副新手套，并應勤于更換。
（3）準備專供自己使用的成套試劑，分裝為小份，而且最好在靠近工作臺的冰箱中設立專門位置來保存。這些試劑不得用于其他用途。配制這些試劑時，要用從未接觸過實驗室內所用任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后便將這一小份全部廢棄，不得重新置存。
（4）裝有PCR試劑的微量離心管打開之前，應先在專用工作臺內的微量離心機上作瞬時離心（10秒）。這樣可使液體沉積于管底，從而減少污染手套或加樣器的機會。
（5）最好在加完所有的其他反應成份、包括防止蒸發用的礦物油后才吸加模板DNA。將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕彈擊管側壁，以混勻液體。再作瞬時離心（10秒），使水相和有機相分開。
（6）將模板DNA加入PCR系統時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應。所有并非即用管均應蓋嚴。拿過模板DNA管后應更換手套。
（7）每一次PCR必須包含陽性和陰性對照。陽性對照用于監測PCR反應的效率，而陰性對照用于確定是否存在DNA靶序列的污染。
（8）只要有可能，就應當設置陽性對照反應（即由少量適當的靶序列參與的PCR）。對靶序列DNA所作的適當稀釋工作應于實驗前在實驗室內別的位置進行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實驗室專門進行PCR的位置。
（9）必須設置一個不含模板DNA，但含有PCR系統中所有的其他成份的對照反應，這一對照管須在準備好其他所有PCR以后才進行吸加。