PCR引物設計及評價實驗（一）分析測試百科網wiki版

發布時間：2020-08-11 10:29 原文鏈接： PCR引物設計及評價實驗（一）

實驗方法原理	聚合梅鏈式反應（polymerase chain reaction）即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱基因的體外擴增法。PCR技術已成為分子生物學研究中使用最多，最廣泛的手段之一，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環，使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行，可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。
實驗步驟	一、引物搜索 1. 打開Primer premier5.0軟件，調入人瘦素（leptin）基因序列：點擊“file” “open” “ DNA sequence”；或者直接點擊 “file” “new” “DNA sequence”，彈出一對話框如下圖，然后將序列人瘦素(leptin) 基因復制在空白框。 2. 序列文件顯示如圖，點擊“Primer”； 3. 進一步點擊“search” 按鈕，出現“search criteria”窗口，有多種參數可以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。我們將Product Size設置300－350，其他參數使用默認值。然后點擊“OK” ，隨之出現的Search Progress窗口中顯示Search Completed時，再點擊“OK”。 4、這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標。

實驗方法原理

聚合梅鏈式反應（polymerase chain reaction）即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱基因的體外擴增法。PCR技術已成為分子生物學研究中使用最多，最廣泛的手段之一，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環，使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行，可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。

實驗步驟

一、引物搜索

1. 打開Primer premier5.0軟件，調入人瘦素（leptin）基因序列：點擊“file” “open” “ DNA sequence”；或者直接點擊 “file” “new” “DNA sequence”，彈出一對話框如下圖，然后將序列人瘦素(leptin) 基因復制在空白框。

2. 序列文件顯示如圖，點擊“Primer”；

3. 進一步點擊“search” 按鈕，出現“search criteria”窗口，有多種參數可以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。我們將Product Size設置300－350，其他參數使用默認值。

然后點擊“OK” ，隨之出現的Search Progress窗口中顯示Search Completed時，再點擊“OK”。

4、這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標。

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