PCR擴增產物的電泳分析2

2）染色劑：核酸電泳后，需經染色后才能顯現出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色。
溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發下，發出紅色熒光。根據情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當溴化乙錠太多，凝膠染 色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察。
銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩定的復合物，然后用還原劑如甲醛 使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色。 也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比EB高200倍。但銀染色后，DNA不宜回收。
4、電泳
1）電泳裝置：電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等。
2）電泳方法
①用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈。放在水平桌面上，并架好梳子。
②根據核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%濃度的瓊脂糖用于電泳。
③配制0.5XTBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內加熱熔化。冷卻至60℃(需要時可加入溴乙錠)，倒入電泳槽中，待凝固。

④向電泳槽中倒入0.5XTBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子。如樣品孔內有氣泡，應設法除去。
⑤在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內。
⑥接通電源，一般紅色為正極黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣 孔的一端為負)。電壓為1-5V/cm(長度以兩個電極之間的距離計算)。
⑦根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。一般200～400bp的PCR產物50V電壓， 電泳20～40min即可。
3）溴化乙錠染色后，紫外儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準比較被擴增產物的大小。
二、聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其裝載的樣品量大，回收DNA純度高。長度僅相差 0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯接而形成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見表2.。

*表中給出的數字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數目(bp)。

1、材料
1）電泳儀器：電泳儀，垂直電泳槽及其附件。
2）30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 裝于棕色瓶內，4℃可保存二個月。
3）10%過硫酸銨 過硫酰銨，1克 加水至，10ml 4℃可保存一周，-20℃可保存一個月。
4）1XTBE電泳緩沖液
5）TEMED(四甲基乙烯基二胺)
2、聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳
根據分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠。
1）按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。
2）將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。
3）按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數。
4）加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止。
5）立即插入適當的梳子，密切注意防止梳齒下產生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機會。
6）室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE 緩沖液。
7）小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合，產生不規則的表面，將導致以后DNA電泳帶型不規則。
8）將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內，加樣時不要產生氣泡。
9）接好電極，電壓為1-8V/cm，進行電泳。
10）根據指示劑遷移位置來判定是否終止電泳。
11）電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻 璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上。浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶 液中，15～30min后取出水洗紫外儀下觀察結果。
12）聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶。要求更高的靈敏度，可用銀染。