高等生物遺傳圖譜的構建依賴于選擇性雜交后代的分析或者通過家系分析法來計 算連鎖關系。對人類而言僅后者是可行的。使用長度多態性限制片段（RFLPS）在構 建人連鎖圖譜方面已取得長足的進步。為了對帶有與已知表現型相關的RFLP標記的基 因進行定位，首先得建立間隔約10CM的遺傳標記束（平均1CM等于1％重組），這樣沒 有基因離標記RFLP的距離會超過5CM。可靠的統計表明家系分析能夠檢測的遺傳間距 精確到1cM(1cM相當于1000kb的DNA。分析更小的遺間距需要檢測家族內大量的個體， 而這實際上是行不通的。
最近發展了一種不依賴遺傳交叉或家系分析的方法檢測遺傳標記間的重組頻率。 具體方法是直接決定配子(精子)的基因型是親本型還是重組型。這通過確定兩個等位 基因中哪一個存在于雙雜合男性精子上的兩個基因座點其中之一來完成。根據上述方 法確定的重組精子的數量被總檢測精子數除就可估計出重組頻率。已知聚合酶反應在 體外擴增基因能夠使DNA擴增109倍，因此該技術有可能分析精子中單分子靶DNA。以 這種方式研究數千個人精子就有可能構建比家系分析要精確得多的遺傳圖譜。該方法 提供了一個獨物的手段來研究許多現在被認為是不能解決的人類遺傳學領域的難題。
用PCR確定精子類型的原理
從人類家系分析的觀點來看，每個個體都是親本減數分裂產生的單個產物的融合 體。雙親以及后代體細胞DNA的研究加上適當的統計學方法可推知形成合子的減數分 裂產物的重組或非重組的性質，同時可以估計重組在減數分裂中所占的比例。我們研 究遺傳重組的方法與上述的不同，它通過分析減數分裂產物本身的DNA來決定減數分 裂發生重組的比率。每個男性一生中可產生大量的減數分裂產物精子，從而提供了進 行遺傳分析取之不盡的實驗材料。
假設一個男性雜合子有兩個連鎖基因座。每一個基因座的多態性差異在于AT-AT 或GC-GC)要么是重組型(AT-GC或GC-AT)。重組類型出現的頻率將取決于兩個基因座彼 此間的遺傳間距。通過檢測某一個體的大量精子，可精確地計算出四種精子類型出現 的頻率。該技術存在的困難在于確定減數分裂前細胞中的每個基因座上存在的兩種等 位基因中的哪一個進入單個精子。常規的分子生物學技術沒有足夠高的靈敏度分析精 子染色體DNA的單個分子。
PCR擴增每個基因座的多態性區域是分析精子的第一步。兩個基因座用兩組引 物，同時引物必須位于多態性區域的邊側。當精子兩個靶序列經PCR擴增，就確定了 每個基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探針可識別等位基因小到僅發生單 個堿基置換的實驗方法已得到改進，這些等位基因牧場劃的寡聚物（ASO）探針第一 次應用是將人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因與鐮刀形紅細胞（βA）的突變 區分開來。本方法檢測等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的長19bp)。 每個寡核苷酸與一個等位基因完全互補而與另一個等位基因通常只有一個堿基的差 別。同位素標記的寡核苷酸分別與待檢測擴增的DNA樣品雜交。在適當的雜交條件 下，只有樣品中的序列完全互補時，寡核苷酸可形成穩定的雙螺旋。例如，精子的 PCR產物用四種ASO探針分析。有一對ASO分別將基因座1的兩個等位基因區別開，另一 對將基因座2的兩個等位基因區別開。實際上，預期兩個ASO中只有一個與某一個減數 分裂產物雜交，可以確定每個檢測的精子對于所研究的染色體而言實際上是單倍體。
人單倍體細胞有1.5-5X10-24摩爾單一DNA序列。根據以前的實驗結果，我們知道 活性達5μCI/微微摩爾的同位素標記就能夠在不到一天的時間內檢測出1毫微微摩爾 （10-15/10-24）。即使以較低的平均擴增效率，大約經50個擴增循環便可完成。
單個細胞的PCR分析
單個二倍體細胞
在分析單精子以前，Li等人對個體二倍體細胞內的β珠蛋白基因進行過研究。兩 個組織培養細胞株用于這些實驗。其中一個純合是鐮刀型細胞密碼子6（βS）發生突 變，另一個純合子則來源于正常的βB等位基因。擴增含有密碼子6的β珠蛋白片段的 引物，及能夠區別這兩個特異的等位基因的寡核苷酸探針（ASO）已經報道過。βA純 事細胞和βB純合細胞和βS純合細胞在同一組織培養瓶中共同培養數天。將用相差顯 微鏡觀察到的混合培養的單個細胞轉入溥塑料胡管內。分別將單個細胞轉入含裂解液 的PCR管中，保溫后，加入PCR緩沖液，緩中有四種dDNP．Taq DNA聚合酶和擴增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分鐘變性靶DNA，然后根據已發表方法的改進方案進行 50全循環的擴增。通過打點雜交，等量的擴增產物打點于尼龍膜后，擴增產物分別與 βA和βS的探針雜交。所分析的37個細胞中，84％細胞只與βA和βS探針雜交，雜交 強弱各不相同；19個與βA探針．12個與βS探針雜交。12個以水作空白對照的反應管 中瓜呈陰性，它表明忽略不記DNA的污染。沒有與兩種探針都雜交的樣品，它暗示轉 入到反應管中的單個細胞，而且組織培養基中存在的從βA或βS細胞中裂解出來的 DNA并未吸附在單個細胞上。
單個細胞的PCR擴增產生的β珠蛋白基因的數量通過與已知攜帶蛋白基因的質粒 DNA樣品在雜交模上的雜交信號的強度進行比較確定。據估計PCR反應開始時，一個二 倍體細胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩爾）在5－500毫微微摩爾之間，每個PCR循環以 平均效率65％計算，經50個循環后它的DNA相當于平均擴增了7.6×1010倍。考慮到擴 增的程度之大，因此排除任何可能的污染對于單個細胞的分析十分關鍵。
單精子的分析
Li等人隨后對位于染色體19編碼LDL受體(LDLr)的基因的雜合體單精子的基因型 進行分析。根據已知的DNA序列，他們用PCR和ASO分析檢測LDLr的RFLP。PCR的引物和 探針以前已有報道。單個精子的分離與二倍體細胞的分離方法一樣，精液經蔗糖梯度 離心得到純化的精子，精子于－20℃可保藏8個月。顯微鏡下將單個精子吸入毛細塑 料針管內，然后轉入試管內以作裂解。裂解的方法與發表的方法沖液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明膠），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保溫1小時，加入PCR反應物以前，樣品加熱到85℃。PCR擴 增。對80個精子LDLr基因型已作過分析。55%的雄配子顯示出雜交信號。22個攜帶 LDLr等位基因，21個攜帶LDLr2基因。僅一個與兩種探針雜交都呈陽性。16支對照反 應管中加入所有反應試劑但沒有精子，結果無雜交信號出現。兩個擴增的等位基因的 分布遵循Mendel獨立分離定理，它表明PCR反應以單個減數分裂產物為起始，無污染 的二倍體DNA存在。
Li等人隨后又對進行重組研究十分關鍵的單精子的兩個不同基因座的DNA序列進 行擴增。供體雄配子的第六條染色體上的HLAAQα基因座及第十九條染色體上的LDLR 基因是雜合的。最初想在LDLR和DQα引物存在的條件下同時擴增兩個基因座的全序列 的努力未能成功。取而代之，在兩對引物存在時，先擴增20個循環，經這種最初擴增 以后，將1／50反應混合物加入試管內，用只含HLA引物的PCR緩沖液稀釋，另一份同 等量的反應混合物經只含DLDR引物的PCR緩沖稀釋，再進行45個擴增循環以后，用第 二次反應產物的一部分與具有等位基因位點特異的兩個ASO雜交。123個樣品（85％） 有雜交信號。剩下的27個樣品無擴增位點。123個樣品中有9個至少發現在兩基因座其 中之一有兩個等位基因，而對這些樣品未作進一步的分析。這些樣品中可能有不同基 因型的兩種精子，而不是由于減數分裂連鎖造成的。因為最近細胞學有關人精子的研 究結果表明單個染色體的平均連鎖頻率在0.1％水平，遠遠低于所觀察到的頻率。
在剩下的114個精子中，LDLR基因座有96個已經定型，其中45個為LDLRL、51個為 LDLR2。兩等位基因的比率理論值為1：1（平方差＝0.375，0.75>p>0.5ldf)88個的 DQα等位基因的分離處于具有統計學意義的臨界值（平方差＝3.68，0.1>P>0.05， ldf)。上述結果表明：1）統計上的不穩定性，2）由于該基因座具有大量的多態性， PCR引物與供體DQαDNA序列之間的錯配導致兩個DQα等位基因不均等擴增，或3）一 些異常的遺傳現象如異常分離。
114個精子中有70個（61％）在兩個基因座可見到雜交點。染色體6和染色體19的 獨立分離應該出現同頻率的四種可能的配子：DQA1，LDLrl;DQA1，LDLr2;DQA2， LDLfrl;DQA2，LDLr2。Li等人觀察的結果每種類型分別為21，18，14和17個，這些結 果與所預料的分布無明顯差異（平方差＝1.43，0.75>P>0.5，3df）。結果表明可以 同時在兩個不同的遺傳位點可靠而有效地確定單個精子的基因型。
在有一個雜交信號的114個雜交樣品中，18個有兩個DQα等位的基因中的一個， 但LDLR產物未能檢測到。26個精子有兩LDLR等位基因中的一個，但沒有擴增HLA基因 座。由于已知連鎖不大可能擴增，因此在這些精子中被研究的這兩個染色體有一個是 缺對的（缺對染色體）。
LDLR和DQα基因座擴增的相對頻率幾乎是相等的。141個樣品中88個擴增DQα． 96個擴增LDLR。因此檢測DQα和LDLR擴增產物的可能性分別為62％和68％。上述結果 僅為估計值，因為實際上不能夠確定141個樣品都只含有單個精子。
但可用下列數據估計樣品的預期頻率：1）兩個基因座上的單等位基因的擴增， 2）僅一個位點的擴增，或3）假設每個基因座的擴增是獨立進行的，沒有基因座笪到 擴增。結果表明69個精子的兩個基因座的單等位基因被擴增了，45個只有單個基因座 的單等位基因進行了擴增，27個無基因座擴增。當觀察的實驗結果與獨立擴增的頻率 相比較時，結果具有很高的統計學意義（方差＝13.0，P>0.995，2df）。其余的精子 則只有兩個基因座的擴增或無基因座擴增，以及遠低于預期的兩個基因座中單一位點 擴增。結果與裂解的雄配子適宜于兩個基因座的擴增或未裂解的精子不能夠進行兩個 基因認的擴增相一致。因此，如果樣品裂均勻，兩個基因座的擴增就可能不是獨立進 行的。因此，一個靶DNA分子同PCR反應物的親和性與其它靶DNA分子的親和性成正相 關性。可以通過改進裂解過程進而增加靶DNA的親和性來提高單精子的擴增率。
構建遺傳圖譜
三位點雜交。在DNA水平上能夠對單個精子分型將會提供一條新的途徑來決定DNA 多態性的物理順序，而這些順序的連接是如此地緊密（少于1％重組）以致于用家系 分析的方法是無法確寂的。在隨機多態性與致病基因座緊密連鎖的情況下該方法特別 有意義。由于該方法能夠檢測大量的減數分裂產物，即使緊密連鎖的多態性也能夠通 過三點雜交來排序。這類精細的結構圖譜可能在導致疾病的基因座的定位方面具有十 分重要的價值。當然，由于精子并不具有疾病的表現型，不能直接用該方法對一個未 知的疾病基因座多態性進行與DNA多態性相關的圖譜定位。根據實驗遺傳學的經典方 法能夠用三點雜交法來推知染色體上的遺傳標記的線型排列。假設一個男性是三因子 雜合體，這3個因子在一個染色體上三個緊密連鎖的基因座A，B，C上，其相對應的等 位基因區段為a，b，c，且三個基因座的順序未知。用單精子定型的方法可推知這些 遺傳標記的相位。這是因為對于緊密連鎖的多態性，最常見的精子類型是非重組的。 根據在八種可能的減數分裂產物中所能觀察到的兩種最少的類型，就能決定它的順 序。于是，如果ABC和abc為最常見的類型，那么這些類型為非重組的。如果為ABc， 與此相對的等位基因abC、AbC和aBc的數量居第二，aBC和Abc最少見，那么后兩種減 數分裂產物可預期為雙交換所致。如果基因座A位于B和C之間（BAC和CAB），與此相 關的頻率就是所預期的結果，于是就可以確定基因的順序。
Michael Boehnke（密執安大學）根據精子三點雜交的結果已設計出一個卓有成 效的方法來決定基因的順序。Boehnke的計算表明如果相鄰遺傳標記的間距低至0.5% 的重組，只需對少到600個配子的分析就能夠精確地決定三個基因座的次序。我們要 指出，即使同種標記的完全重組頻率在男性和女性之間也有所不同，但該方法確定基 因座的次序對“假象”對這種研究的分辯率無絕對影響，在擴增過程中三對引物同時存 在的條件下，擴增的效率也不會受到影響。最近已有報道使用大量的基因組DNA（與 單個精子相對）可同時擴增多至七個獨立的片段。在單精子的擴增過程中同時用5對 引物，結果表明特異的靶DNA以高效率擴增，沒有由于另外四個基因座的同時擴增而 受到影響。
多態性標記的選擇。為了使多態性在用PCR對精子分型中有用，一定得知道位于 多態性位點兩側的序列。每一側的已知序列不必超過20－30BP，這已為PCR引物的選 擇提供了回旋的余地。不幸地是許多具有RFLP的cDNA和基因組克隆的本身無多態性位 點，因此需要進行額外的克隆和序列分析以使它有用于PCR分析。除了要知道用作引 物的序列，通常不對RFLP進行大范圍的分析來揭示核苷酸的替代情況。在有些情況 下，PCR產物可用限制性內切酶酶解直接分析RFLP，盡管在單個細胞的實驗中我們常 常看到經EB染色后出現的多條帶干擾了研究對象。此外，大多數樣品進行限制性酶解 以及凝膠電泳（可能是Southern印跡雜交）將會比打點雜交要費力得多。
以連續重復序列或VNTR的不同數目為基礎的RFLP，它的特殊形式在常規的基因圖 譜的研究方面十分重要。如果能得到重復單位的基因族兩側的20－30BP的DNA序列， 經PCR、凝膠電泳、EB染色就有可能區別等位基因。在DNA基因組研究方面，最近已有 對經PCR擴增的VNTR進行分析的報道。如果有可能消除單個細胞擴增實驗出現的多條 帶，VNTR多態性就能夠用于精子分型的研究。
是將已知RFLP轉變成可用PCR分型的標記更為有效還是設計快速檢測多態性的技 術更容易適合于PCR分析目前仍不清楚。當然，有許多新方法與PCR結合用來檢測多態 性。Leonard Lerman的變性梯度凝膠電泳法（DGGE）可成功地檢測出單個堿基的突 變，該方法使用GC發夾或者用經多個限制性酶解的改進DGGE可分析PCR產物。PCR產物 中的核苷酸置換也可以用RNaseA錯配分析法來分析。一旦用上述方法檢測出了多態性 時，它的位置以及該閏點附近的序列就不難確定了，這樣也為ASO探針的合成提供了 必要的數據。運用這些新方法，可從已經過Southrn雜交和圖譜分析檢測的RFLP克隆 中發現新的多態性。這可能在加速將RFLP轉變為PCR分析以及對與致基因座緊密連鎖 的RFLP進行定位等方面具有重要的意義。
對常規圖譜分析的影響。能夠確定單個精子的基因型對用家系法對常規基因圖譜 進行分析具有重大的影響。當雙親的遺傳標記的相位已知時，就可獲取最大限度的有 關家庭研究的情況，而這方面的情況常常是無法獲得的。
用單個精子的定型法，通過觀察哪一類精子最多就能容易地確定父親的相位。當 遺傳標緊密連鎖時，可確定非重組染色體，便也確定了標記的相位。
研究重組與物理間距之間的關系
能夠對大量減數分裂產物分裂的另一大好處是將有可能對遺傳標記在物理意義上 非常靠近的重級頻率進行精確的定位。結合大片段DNA和染色體凝膠電泳的方法，有 可能測得精確物理距離已知的遺傳標記之間的重組頻率。這就能夠對染色體特異區域 的重組頻率和物理距離之間的關系進行比較，這些特異區域的重組平均值是常規采用 的每百萬個堿基對發生1％重組。
能夠檢測物理間距很短的重組將在重組熱點垢研究方面特別有用。根據大量的不 平衡連鎖的數據，人的重組熱點存在于β血紅蛋白編碼區域、胰島素基因座以及免疫 球蛋白的重鏈區域。染色體X和Y的假常染色體區域的重組率比1％／1000KB的平均重 組率高出20倍。在一個長的DNA片段內通過家系分析來確定特殊的熱點區域將是非常 艱巨的任務。很明顯，任何能夠估計出小DNA片段之間可能發生重組的技術將對了解 重組增強的分子機制提供有價值的資料，而且同時可能有助于對重組過程本身認識。
其它應用
由于有可能從單個個體中獲取具有統計意義的重組頻率數據，因此同時也應該能 夠確定不同男性的相同染色體間隔的重組率是相同還是不同以及是否特定間隔的重組 率隨年齡的變化而變化。從而能夠為遺傳學的研究提供有價值的資料。
不能夠進行大量繁殖或繁殖周期很長的生物體，單個精子分型是構建這些生物體 的遺體圖譜唯一實際可行的方法。這或許對研究靈長類如黑猩猩等具有特別重要的意 義，因為物理圖譜和單精子重組的研究可能為我們提供有關重組進化的知識，以及由 重組而產生的變異在人類進化過程中所起的作用。
非精子單細胞DNA序列的研究使得有可能研究適涉到在DNA重排或其它遺傳改變的 發育過程中細胞與細胞之間的變異，該方法同樣具有一定的重要性。同樣有可能對移 植前的體外受精胚單細胞進行產前診斷。
總之，單個精子或二倍體細胞的DNA序列分析能夠提供獨特的方法，不僅僅解決 人類遺傳學出現的難題，而且能夠解決生物學其它領域出現的難題。
