PCR檢測的質量控制

隨著獸醫防疫工作重要性的逐步提高，PCR檢測技術已被獸醫工作者比較廣泛認可，已經從實驗室研究走進了臨床應用階段。如何提高PCR檢測質量，已成為實驗室技術人員不可回避的一個問題，它直接影響實驗室檢測結果的可信度和獸醫防疫工作質量。
我們認為，PCR檢測質量的控制是一個系統工程，總體上涉及三個方面：一是試驗儀器；二是試驗試劑與耗材；三是人員操作。任何一個方面出現問題，都會影響PCR檢測質量。

一、試驗儀器
PCR儀和紫外凝膠成像系統（紫外分析儀或手提紫外等）以及移液器都可能影響PCR檢測的質量。PCR儀是控制PCR反應溫度變化的，其溫度和控制時間的準確程度可能會影性PCR檢測質量。移液器取液的準確程度影響反應體系是否能達到最佳反應環境。紫外分析系統對檢測敏感性有明顯的影響。紫外分析系統有3種類型儀器：紫外分析儀、紫外凝膠成像系統、手提紫外燈。紫外分析儀直接用眼睛觀察瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶。紫外凝膠成像系統是在計算機上通過攝像系統對瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶進行觀察。手提紫外燈可以在電泳過程中直接對瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶進行觀察，使用方便，分辨率比較低。依據這些儀器的分辨率由高到低順序是紫外分析儀、紫外凝膠成像系統、手提紫外燈。紫外分析儀有時能看到弱陽性擴增帶，在紫外凝膠成像系統上卻看不到。手提紫外燈只有在陽性擴增帶比較亮時才能看到，建議為保證檢測質量最好不用手提紫外燈，可用于臨時的電泳結果觀察。
儀器的質量控制應該通過實驗室質量認證來實施，定期進行儀器的效驗。沒有質量認證的實驗室可以定期請儀器生產廠家進行效驗和保養，確保所有儀器處于正常的工作狀態。

二、試驗試劑與耗材
在PCR檢測質量控制中，試劑的選擇具有十分重要的作用，也是實驗人員最為關注的檢測質量控制因素。試劑一定選擇質量和信譽好的廠商，一但選定后最好不要輕易改換。如果必須改換時應與原產品進行嚴格比對試驗，包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗。并且經常要注意不同批次產品質量的差異。比如說TaqDNA聚合酶，不同廠家生產的質量是有差異的，盡管都是標出相同活性單位，但其標定方法和保存液的成分以及運輸過程的不同常常導致實際活性單位是有差異的，有時由于其活性低，使得弱陽性樣品漏檢；有時由于其活性過高出現非特異擴增。這與ELISA檢測中酶結合物的作用相似。其實影響PCR檢測結果的試劑很多，可以這樣說，PCR檢測用的所有試劑都可能影響檢測效果。控制試劑的質量是作好PCR檢測前提。我們認為：最好是選擇PCR試劑盒來控制試劑質量。
評價一種PCR試劑盒，除了考慮它的敏感性、特異性、穩定性、操作簡便程度外，還應包括：試劑盒提供的試劑覆蓋整個PCR檢測試驗的程度。如果試劑盒提供了整個PCR檢測試驗的試劑，表明該試劑盒對PCR檢測試驗的試劑具有了全程控制性能。相反，PCR檢測的試劑的質量控制程度比較低，意味著檢測質量可控程度低。例如：溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用，如果在陽光下長時間的照射下失效了，在紫外燈下發熒光效能降低，可能會造成一些弱陽性樣品的漏檢，出現假陰性。其它試劑出現問題也是一樣影響檢測質量。試劑盒在生產過程中，有一套試劑生產質量控制體系。每一試劑組分都經過靈敏度、敏感性、特異性質量控制的檢測，在有效期內能確保每種試劑的質量。因此，選擇試劑盒進行PCR檢測是比較理想的控制方法。在PCR檢測中，最好全部使用試劑盒提供試劑，對PCR檢測質量控制有益。
實驗耗材也是影響PCR檢測質量的因素之一。PCR反應管薄厚以及傳導熱量性能等直接影響PCR檢測效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油，但有些PCR反應管蓋子不嚴密，導致擴增過程中反應液水份蒸發，嚴重影響檢測靈敏度。PCR反應體系是微量的，移液器的Tip頭生產質量不好時，有時致使液體殘留量多或洪吸作用強，導致試劑盒中試劑量不夠，配置PCR反應體系不準，造成檢測質量下降。
在每次PCR檢測時，一定設立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。因此，每次試驗都應設立表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉錄）、DNA擴增和電泳鑒定對照，只有設立試驗全程的對照，才能證明試驗結果成立。這一點對PCR和RT-PCR檢測試驗是非常重要的。
陽性對照在試劑盒中是必須有的組分。設立陽性對照有3種類型：第一種是用檢測的病原微生物作為陽性對照。這樣的直接對照優點是直觀、準確、本次試驗完整條件對照，可以說明此次試驗是否成立。缺點是對檢測過程中增加了PCR污染的指數。另外，不能表明每個檢測樣品對照成立。第二種是設立一種與檢測病毒無關微生物作為陽性對照。優點是降低了PCR污染的危險性，并且提高了試劑盒的生物安全性。缺點是僅是參考陽性對照，不夠直接、完全反映本次試驗成立，也不能表明每個檢測樣品對照成立。可適合怕污染的實驗室或要求生物安全等級高的病原微生物的檢測。第三種是在每個反應管內設立參考對照，除了陽性擴增帶之外，又設立一條擴增帶，指示每個反應管內檢測情況。檢測為陽性時出現兩條不同大小擴增帶，陰性時出現一條擴增帶。這種對照設立技術要求高，成本也高些，對照效果是最理想的，可以排除每個檢測樣品操作失誤或試劑出現問題對檢測造成的影響。由于在一個反應管內對兩條模板同時進行擴增，相互之間多少有一定的干擾，因此，對病原微生物檢測靈敏度或多或少有一定影響。此種對照方式可能會成為PCR對照的發展趨勢。

三、人員操作
我們多名實驗室人員曾經對相同樣品同時進行檢測，檢測結果確實存在差異。經常檢測人員比其他實驗人員檢測的靈敏度高10~100倍。說明PCR檢測的試驗確實有一定的操作技術需要熟悉和訓練，不同的人員對檢測結果有一定的影響。加強人員的操作技能的訓練是必須的，需要實驗技術人員對PCR檢測有一個熟練的過程。
PCR污染控制是PCR檢測操作人員必須非常注意一項內容。實驗室設置上分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區。物流應按分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區順序，嚴禁倒流。人員操作也應非常注意，比如注意經常打掃衛生消毒、對移液器要定期進行清洗、消毒。及時試驗操作簡便、快速、準確等。