PCR測序方法你知道幾種？（一）

自從 Sanger等(1975)引人雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)作為鏈終止劑,DNA序列測定技術得到迅速發展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通過其5三磷酸基團可以摻入到正在延伸的DNA鏈中,但由于其脫氧核糖3位置缺少一個羥基,因此不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵,使得DNA鏈的延伸被終止。根據此原理,在DNA合成反應混合物的4種dNTP中加入一定比例的一種 ddNTP,dNTP參與的鏈延伸將與ddTP參與的鏈終止發生隨機競爭,最終反應產物是一系列的寡核苷酸鏈,其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨立的酶反應中分別采用4種不同的dNTP,結果將產生4組寡核苷酸鏈,它們將分別終止于模板鏈的每個A、C、G或T的位置上,通過電泳分離和放射自顯影,就可以進行序列判讀。

PCR測序根據標記的方式不同和循環的次數不同可分為直接測序法和循環測序法。

直接測序法 

一、原理

PCR擴增獲得雙鏈DNA產物經變性形成單鏈,測序引物與其中一條模板鏈上的互補序列退火。退火的引物在低進行性反應條件下(如低溫和低dNTP濃度),通過DNA聚合酶催化作用延伸20~80個核苷酸;由于此反應體系中摻入放射性標記的dNTP,能使新合成的DNA鏈中含有多個放射性標記,便于產生高放射顯影度。標記的DNA鏈在高進行性反應條件下,通過DNA聚合酶催化進行延伸,通過在反應體系中摻入 ddNTP,使鏈延伸反應終止。反應產物經過電泳分離和放射自顯影,就可以進行序列判讀。

二、材料

(1)DNA模板PCR產物離子交換色譜純化,作為DNA模板,濃度為:0.01~0.1mmol/L。

(2)引物20個核苷酸的DNA引物可以不經過純化,直接用作測序引物,引物濃度 l mmol/L

(3)DNA聚合酶要求該酶在低溫條件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA鏈中摻入放射性標記。比如USB/ Amersham公司生產的測序酶2.0。

(4)測序反應緩沖液根據測序酶具體而定,如測序酶2.0的反應緩沖液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.

(5)放射性標記的dNTP一般為[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

三、方法

(1)制備鏈延伸終止反應混合物分別在4個微量離心管中各加入一種 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP濃度分別為80m0/L和8pmol/L,37℃預熱5mine

(2)制備退火混合物在一個微量離心管中加入PCR擴增DNA1pmol,測序引物1012p5×測序反應緩沖液,用水調整至總反應體積10pl

在加熱儀內94~96℃加熱8min后,迅速放入冰浴中冷卻lmin(適合于雙鏈DNA模板),或者在加熱儀內65℃加熱6min后在加熱儀內自然冷卻到30℃(適合于單鏈DNA模板)。

1000r/min離心10s后在冰浴中冷卻,并迅速進行下一步操作。

(3)標記反應在退火混合物中加入2l預冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,現稀釋的測序酶2U,并用水將反應體系調整到15.5,混勻后在冰上孵育2min,放射性標記新合成的DNA鏈。

(4)鏈延伸終止反應將3.5標記混合物分別加入4管鏈延伸終止反應混合物中,37℃進行鏈延伸終止反應5min。

(5)終止反應體系在各管中加入4終止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),終止反應。樣品可以一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min。

(6)電泳分離和放射自顯影每一泳道上樣2~3μl,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

P標記的需要過夜曝光顯影,若用P標記的需要2~3d曝光顯影,讀片。

四、注意事項

①標記反應最為關鍵,應在低進行性反應條件下進行。退火后引物只被延伸20~80個核苷酸,并在新合成的DNA鏈中摻入多個放射性標記。對高GC堿基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。

②對高GC堿基含量的DNA模板,鏈延伸終止反應混合物中應用7-脫氧2dGTP替代dGTP,以消除電泳過程由于壓縮現象產生的假帶。

循環測序法 

一、原理

循環測序法是利用熱循環儀高效的自動循環能力,使鏈終止的序列產物以線性方式獲得擴增,從而產生高顯影度的序列梯度。首先將PCR擴增的DNA經變性形成單鏈形式,使標記引物(P、生物素或熒光標記)與其中的一條鏈上的互補序列退火。退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發生鏈延伸終止反應。由此產生的模板鏈與延伸終止鏈形成的部分雙鏈產物在下一輪測序循環中,再次被變性,釋放出模板鏈,作為又一輪引發反應的模板,同時積累下每輪循環產生的鏈終止產物。這種循環步驟重復20~40次,使鏈終止產物以線性方式擴增。

與直接測序法相比較,循環測序法有如下優點:所需的模板DNA量少;在高溫下進行,可使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域;多輪的變性步驟便于對質粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR產物等雙鏈DNA模板進行測定,不需要經過一個單獨的變性步驟而直接進行測序。

二、材料

(1)模板可用PCR擴增好的DNA作模板,也可使用低濃度的dNTP(10~20mol/L)和引物(1mmol/L)來進行靶DNA的PCR擴增,然后直接用PCR產物作為模板。DNA模板濃度:0.01mmol/L

質粒DNA模板用質粒純化試劑盒提取。對于高拷貝數的質粒可以直接從菌落中獲得測序。測序反應的質粒典型用量:50~200mol

其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制備為常規分子生物學手段。M3和ADNA作為模板用量:10~100mo黏粒DNA作為模板用量:50~200mol