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  • 發布時間:2018-07-12 21:27 原文鏈接: PCR簡介/PCR儀

    PCR的要素

    基本的PCR須具備

    PCR儀PCR儀圖冊

    1.要被復制的DNA模板 Template

    2.界定復制范圍兩端的引物Primers.

    3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

    4.合成的原料(四種脫氧核苷酸)及水。

    PCR儀工作原理

    利用升溫使DNA變性,在聚合酶的作用下使單鏈復制成雙鏈,進而達到基因復制的目的。

    PCR的反應包括三個主要步驟

    分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱(至90~95℃)變性, 將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以做為復制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60℃)附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75℃)進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。

    PCR的最早設想核酸研究已有100多年的歷史,本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術,Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想:“經過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

    PCR的實現

    1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制,只是

    PCR的改進與完善

    Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片

    段,其缺點是:

    ①Klenow酶不耐高溫, 90℃會變性失活,每次循環都要重新加。

    ②引物鏈延伸反應在37℃下進行,容易發生模板和引物之間的堿基錯配,其PCR產物特異性較差,合成的

    DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點,

    但由于Klenow酶不耐熱,在DNA模板進行熱變性時,會導致此酶鈍化,每加入一次酶只能完成

    一個擴增反應周期,給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引

    起生物醫學界的足夠重視。

    1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR,其擴增的DNA片段很均一,真實性也較

    高,只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次,仍需加入新酶。

    1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種

    耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點:①耐高溫,在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的

    90%,在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40

    %。②在熱變性時不會被鈍化,不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異

    性和擴增效率,增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率,因而其靈敏性也

    大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區別,將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNA

    Polymerase。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。


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