PCR產物電泳銀染實驗

實驗方法原理

聚丙烯酰胺凝膠（PAG）是由丙烯酰胺單體和交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺，在引發劑過硫酸胺（AP）提供自由基和催化劑四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合而成。丙烯酰胺可由天然光線誘發聚合，所以其水溶液應貯藏在棕色瓶中，置低溫 4℃ 更佳。由于其水溶液穩定性較差，通常 2 個月內用完為好。10％ 過硫酸胺（100 mg 溶于 1 ml ddH2O 中）應 4℃ 保存，兩星期內用完。聚丙烯酰胺凝膠濃度和 DNA 分離范圍、指示劑顯示范圍見表 13-3。

由于 IgH 和 TCR 的 PCR 產物在 50～250 bp 之間，用 12％ 的聚丙烯酰胺為佳。

實驗材料 PCR 產物

試劑、試劑盒 乙醇硅膠聚丙烯酰胺凝膠ddH2O上樣緩沖液Tris 堿硼酸硝酸

儀器、耗材 灌膠玻璃板制膠架固定架

實驗步驟

30％ 聚丙烯酰胺的配制：29 g 丙烯酰胺，1 g 亞甲基雙丙烯酰胺（丙烯酰胺：亞甲基雙內烯酰胺的分子比為 29:1），加 ddH20 至 100 ml，避光，4℃ 保存（丙烯酰胺有神經毒性，避免呼吸進入體內）。

1. 制膠

1.1 灌膠玻璃板清洗去污劑洗滌，自來水沖凈，蒸餾水漂洗，烘干，乙醇浸泡，擦干備用或涂抹硅膠。

1.2 隔條長玻璃和短玻璃板配對放入制膠架內，上緊制膠架，再將制膠架放在固定架夾上夾緊，倒入現配制的 12％ 聚丙烯酰胺凝膠溶液（ddH2O 48 ml，10× TBE 10 ml，30％ 丙烯酰胺 40 ml，10％ 過硫酸銨 1.85 ml，四甲基乙二胺 0.15 ml），插入梳子，勿使梳子齒下進氣泡，10 min 左右可凝固。

1.3 凝固后垂直向上小心提出梳子，放開固定架夾于，取下制膠架松開膠架，再取下凝膠玻璃板；用注射器吸蒸餾水沖洗孔格，以防梳子取出后未聚合的溶液溶入孔格內再聚合而使孔底形狀不整齊，并導致電泳帶型不整齊。然后將凝膠玻璃板成雙并面對面固定在移膠架上，放入電泳槽中。槽內電泳液為 1 × TBE。

[10 × TBE 電泳緩沖液配制：108 g Tris 堿，55 g 硼酸，40 ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）加水定容至 1 L；常溫下保存]。

2. 電泳

2.1 電壓 1～8 V/cm，電壓過高將引起升溫，導致 DNA 帶型彎曲，甚至小片段 DNA 解鏈。電流應為 90～180 mA。

2.2 上樣 4 μl PCR 產物+1 μl 上樣緩沖液（0.25％ 溴酚藍，0.25％ 二甲苯青 FF，30％ 甘油水溶液；4℃ 保存）混合后用細長吸頭打入孔中，DNA 相對分子質量標準（Marker）用 pBR 322 DNA/HaeIII（8～587 bp）。1 μl Marker + 1 μl 上樣液+2 μl 1×TBE 混合后打入孔中，根據上樣緩沖液中含有指示劑遷移距離，判定電泳的終止時間。停止電泳后，取出玻璃板用制膠鏟輕撬開長短玻璃板，用制膠鏟輕輕分離凝膠，放入盛有 ddH2Ｏ 的玻璃器中，清洗 2 遍，倒去 ddH2Ｏ。

3. 銀染

以下各步驟均在搖床上進行。

3.1 固定向清洗過 2 遍的含凝膠玻璃皿注入 10％ 乙醇，固定 10 min；倒去固定液；用 ddH2Ｏ 洗 2 遍，倒去 ddH2Ｏ。

3.2 脫色 1％ 硝酸液脫色 10 min，倒去脫色液，用 ddH2Ｏ 洗 2 遍并倒去 ddH2Ｏ。

3.3 染色 0.2％ AgN03 液染色 20 min，倒去染色液，用 ddH2Ｏ 洗 2 遍以上并倒去 ddH2Ｏ。

3.4 顯色加顯色液，直至認為條帶滿意為止，用 ddH2Ｏ 洗 2 遍，自來水沖洗或放入 10％ 乙酸乙醇終止液中存放。（顯色液：Na2CO3 30 g，甲醛 1 ml，1％ Na2S2O3 0.1 ml，加 ddH2Ｏ 定容至 1 L；常溫保存。）

3.5 存檔凝膠攝錄系統或數碼相機拍照存檔。