PCRELISA端粒酶檢測法

3.1.2組織中提取物的制備：

—測定端粒酶活性的組織標本準備，需要小心的采樣并保存臨床材料，因為腫瘤細胞的污染可產生正常組織中的假陽性信號，而由于不恰當的保存也可在腫瘤樣本中產生陰性信號。如不是立即用于端粒酶PCR ELISA組織樣本應以小片在液氮中休克性冷凍，并保存在-80℃。

—冰上孵育30分鐘。

—2-8℃，16000g離心細胞裂解液20分鐘。可用冷凍臺式離心機及離心管。

—小心將上清液移入新的離心管中，確保無組織殘片被帶入，我們建議僅抽提175μl組織提取物，以標準方法測定蛋白濃度，在液氮中休克性冷凍小份組織提取物，將提取物存放在-80℃。

3.2端粒酶重復序列擴增步驟（TRAP反應）。

—對于每一待例檢測樣本，先將25μl反應復合物加入適合PCR擴增的管中，加入1-3μl細胞提取物（相當于1*10³-3*10³細胞或1-50μg總蛋白）。并加入無菌水至總體積50μl，所有吸取步驟在冰上進行。

—將離心管置于PCR儀中，照下列步驟進行引物延伸/擴增反應。

3.3雜交及ELISA反應流程：

—每個樣品取20μl變性試劑加入適宜的離心管中，若有大量樣本，建議使用無核酸酶包被的微孔板MTP。

—加入5μl擴增產物，15-25℃孵育10分鐘。

—每個離心管內加入225μl雜交緩沖液，用振蕩器完全混勻。

（如需要，雜交混合物量可以用于二次檢測擴增產物。）

—取出100μl混合物加入試劑盒中已包被的微孔板的每個孔中，并用蓋子蓋住小孔以防蒸發。

—將MTP微孔板置于37℃，300rpm的振蕩器中孵育2小時。

—棄去全部雜交液，以清洗緩沖液洗三次，每孔250μl每次至少30秒，小心棄去沖洗液。

—每孔加入100μl抗-DIG-POD工作液，用蓋子蓋上MTP，15-25℃（18-22℃）置于300rpm的搖床上孵育30分鐘。

—完全棄去溶液，以每孔250μl清洗緩沖液沖洗5次，每次至少30秒，小心棄去沖洗緩沖液。

—每孔加入100μlTMB底物溶液預熱至室溫，蓋上蓋子，在300rmp的搖床上孵育10-20分鐘。

——不要移去反應底物，每孔加入100μl終止試劑以終止反應。

注意：加入終止液后等已反應的POD底物的顏色從藍轉黃，這是取得zui高敏感度所必要的。

——使用ELISA酶標儀，測定加入終止液后30分鐘內標本450nm吸收值（參照波長為690nm）。

4.結果分析：

吸光值為A450nm，參照空白對照讀數（A690nm）。

4.1陰性對照：

將細胞提取物與無DNA酶的RNA酶預孵育，降解端粒酶內源性RNA作為檢測端粒酶的陰性對照，另一種方法為熱處理以取得陰性對照。用RNA酶處理標本，陰性對照zui大的吸收值為0.25A450nm-690nm，如果數值較高，整個實驗包括TRAP反應需重新進行。

4.2陽性對照：

陽性對照的吸收值在底物反應20分鐘后檢測，應高于1.5（A450nm-A690nm），相當于使用1*10³細胞進行檢測。如果數值較低，整個實驗包括TRAP反應需重新進行。

4.3樣本：

將樣本的吸收值減去陰性對照的值。如果吸收值的差異（ΔA）高于0.2（A450nm-A690nm）可認為端粒酶陽性。

5.常見問題分析及解決方案

1陽性對照信號過低或無

? 所用熱循環儀的型號不適合所設的熱循環程序，選擇適宜的循環條件。

? 引物延長、擴增所用的水含有核酸酶。必須使用無核酸酶的重蒸水（DEPC或Velcorin處理）來制備試劑。

? 試劑受核酸酶污染。另換陽性對照細胞提取物及樣本重復全部檢測。仔細檢查是否污染了DNA酶及RNA酶。

? 孵育步驟未在300rmp振蕩器下進行。選用合適的振蕩器。

? 抗DIG-POD工作液失效，必須使用新準備的抗DIG-POD工作液，檢查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并準備新鮮的工作液。

2陰性對照信號過高

? 陰性對照、裂解試劑、或反應混合物被端粒酶陽性細胞提取物污染，以RNA酶處理或65℃熱處理10分鐘是陰性對照失活。重復包括擴增在內的整個實驗。

? 陰性對照、裂解試劑、反應復合物、或其它試劑可能被以前實驗的擴增產物所污染。

? 在檢測步驟中，沖洗不充分，增加沖洗步驟。

? 與TMB底物溶液的孵育過長，加入TMB底物溶液20分鐘內停止底物反應。