PCR、qPCR、dPCR你需要知道的事兒

　　上世紀八十年代Cetus Corporation公司的化學家Kary Mullis發明了PCR，如今DNA擴增儼然已經成為了生物學研究的基礎。三十多年以來，人們為了解決研究中出現的新問題新需求，不斷對這一經典技術進行改良。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，PCR技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。如今PCR技術早已走出實驗室，在遺傳學鑒定和疾病診斷中發揮著巨大的作用，在越來越廣闊的領域里煥發著新的活力。

　　PCR方法大比拼

　　PCR的原理在這里無庸贅述。多年來，研究者們已經在此基礎上開發了一系列衍生技術。目前的PCR方法主要可以分為三類：終點PCR、qPCR和dPCR。

　　終點PCR

　　終點PCR是最原始、最簡單的PCR方法，如今仍在被我們廣泛使用。使用者只能在PCR反應結束之后，通過凝膠電泳、毛細管電泳等方法對產物進行檢測。終點PCR本身是無法定量的，因為該反應產出的DNA量不一定能反映最初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴增效率是有差異的。

　　qPCR和dPCR

　　研究者們通過兩種途徑克服了PCR定量分析的挑戰：實時定量PCR（qPCR）和數字PCR（dPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監控PCR過程中的熒光強度比較多個樣品的DNA水平。數字PCR（dPCR）的基本工作原理很簡單，先將樣品劃分為多個PCR反應，每個反應最多只含有一個模板。然后通過計數正負反應來確定初始樣品中模板分子的數量。

　　SYBR? Green是一種在qPCR中廣泛使用的插入性DNA染料。隨著PCR循環的連續進行，這種染料的熒光強度會不斷增強，從而可以使人們對反應中的DNA進行定量。SYBR Green法比探針法成本低，使用也更為方便。不過這種方法也存在著與生俱來的弊端，SYBR Green方法產生的非特異性產物較多，會導致高背景和假陽性。盡管如此，這一久經考驗的技術仍然頗為流行，許多研究人員都是SYBR Green法的忠實擁護者，愿意接受這個技術的小瑕疵。

　　雖然qPCR和dPCR都能夠對樣品中的核酸進行定量，但它們有一個重要的差別。qPCR只能實現相對定量（比如樣品A的靶序列是樣品B的兩倍），除非用標準品生成一個標準曲線。而數字PCR本身就是絕對定量的，不需要做標準曲線。另一方面，qPCR技術更為成熟名頭也更響，市面上有大量的商業化產品可供選擇。dPCR目前還是個小鮮肉，應用沒有qPCR那么廣泛，價格也更昂貴一些。與dPCR相比，qPCR更適合高通量分析，而且動態范圍很寬。

　　dPCR一般來說更為精確。qPCR能夠輕易分辨兩倍的濃度差異（比如5拷貝和10拷貝），但在微小差異面前比較無力。而dPCR在理論上能鑒別差異小于20%的拷貝數，比如5拷貝和6拷貝。這種精確性在有些方面特別有幫助，比如定量涉及染色體重排的基因拷貝數，或者定量癌癥患者血液中的循環生物學指標。由于dPCR分液相當于稀釋樣品，而且在反應結束時讀取數據，dPCR比qPCR更能抵抗抑制劑。

　　重組酶聚合酶擴增RPA（Recombinase Polymerase Amplification）被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。該反應的最適溫度在37°C  -42°C之間，無需變性在常溫下即可進行，這無疑能大大加快擴增速度。RPA檢測的靈敏度也很高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產物。RPA用不著復雜的樣品處理也不需要溫控設備，適合無法提取核酸的實地應用，真正實現便攜式的快速核酸檢測。英國公司TwistDx Inc以RPA為基礎開發了TwistAmp? 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。