QM／MM酶催化反應機制研究

酶反應機理研究是化學、生物學中的核心問題之一，長期以來受到廣泛關注。不過酶催化反應研究相當復雜，無論實驗還是計算模擬都充滿挑戰，這主要是因為酶反應過程的多尺度特性[1]： 如圖1所示，反應底物化學鍵斷裂與生成、蛋白局部氨基酸殘基的運動往往在飛秒到皮秒的時間尺度，若要描述溶劑分子例如水的動力學行為至少需要皮秒時間尺度，蛋白a-helix、b-sheet等二級結構運動周期在納秒級別，而蛋白(酶)折疊等高級結構形成的時間尺度則更長，位于微秒到毫秒之間。當前，基于經典力學和量子力學的QM/MM組合方法被認為是研究酶催化機理最可靠的計算模擬方法之一，特別是結合分子動力學模擬(MD)后，QM/MM MD模擬能從原子、電子層面深入理解酶反應過程涉及的一系列結構和能量演變等關鍵信息。QM/MM方法的最初提出者Levitt和Warshel教授，以及在MD領域培養了海量人才的學術大師Karplus教授，共同分享了2013年諾貝爾化學獎。今天以SpnF酶催化機理為例，跟大家分享QM/MM計算在酶催化機制研究中的應用。

圖1. 蛋白不同類型運動的時間尺度示意圖

圖2. SpnF酶中可能的[4+2]與[6+4]環合反應機制

周環反應在有機合成中有廣泛應用，許多有機人名反應在自然界中都能找到相關功能的酶[2]，例如，催化[4+2]類型Diels–Alder周環反應的酶相繼得到實驗報道[3, 4]，理論模擬方面，以SpnF酶為例，Houk團隊在早期的氣相模擬中揭示了SpnF酶潛在的[6+4]環合分支反應可能性[5]，因而對這類酶是否是單功能的Diels–Alderases，又或者可能存在[4+2]和[6+4]兩種環合反應雜泛性的可能，仍然存在爭議。近期，Houk團隊[6]基于微擾理論的過渡態采樣，以及Hess等人[7]基于全酶體系的QM/MM MD計算都闡明了催化[4+2]反應才是SpnF酶的主要活性，盡管的確存在一個[4+2]與[6+4]分支反應共享的過渡態區域，如圖2所示。

Hess等人選取了二維反應坐標來開展其QM/MM MD 模擬，QM部分選擇的是M06-2X方法，該方法在研究環合反應中廣泛使用。他們通過考慮不同大小的QM區域來獲得關鍵氨基酸殘基對酶反應的調控作用。如圖3所示，隨著關鍵氨基酸殘基，如Tyr23, Thr196和Trp256考慮到QM區域，發生[6+4]分支反應的概率逐步下降，這是因為它們與配體的相互作用（氫鍵和p-堆積），有利于底物處于[4+2]反應活性構象。特別是Thr196效果最為顯著，它與底物的作用削弱了C13?C14雙鍵特性從而抑制[6 + 4]反應性，在Thr196Ala突變模擬中，[6 + 4]反應概率提升到90%而在wild type中[6 + 4]環合反應比重僅占到5.6%。計算還發現，即便反應能形成[6 + 4]副產物, Thr196這一關鍵氨基酸殘基也會促進其進一步重排得到最終的 [4 + 2] 產物。而Tyr23/Trp256與底物的p-堆積作用使得C2=C3雙鍵周圍電子更加離域。SpnF之所以存在一定概率的[6 + 4] 環合反應，主要是Asn148和Leu198殘基對配體的影響，更利于[6 + 4]反應活性。但針對過渡態分支區域開展的詳盡的QM/MM MD采樣結果表明[4+2]環合才是SpnF催化的主反應（圖4）。該論文作者進一步分析提出，與其它已知的Diels?Alderases酶不同之處是, SpnF 酶不僅利用氫鍵作用，還利用了芳香堆積效應來提高酶反應在[4+2]與[6+4]之間的選擇性。這些發現為未來Diels?Alderases蛋白設計提供了重要的理論指導。

圖3. 不同QM區域下獲得的反應自由能圖及其[6+4]產物比重。AàC三個model中關鍵氨基酸數目逐漸增加

圖4. 從過渡態區域出發的QM/MM 非限制性MD 采樣結果統計分析。藍色線代表通往[4+2]產物的反應軌跡，綠色線代表返回反應底物態的軌跡數，紅色線代表了[6+4]分支反應的數目

為了研究SpnF酶和水溶液對分叉反應的影響，Houk團隊[6]則利用其課題組發展的基于環境微擾的過渡態采樣方法（EPTSS），比較研究了在SpnF酶和水溶液中DA反應機理。他們的計算模擬發現，底物分子的過渡態在水和酶不同載體中采取的優勢構象有較大差異，研究結果表明在酶SpnF中存在[4+2]與[6+4]的分叉過渡態，并且針對分叉過渡態對比了水與酶環境下[4+2]/[6+4]產物比率，水中為1.6:1.0酶中為11:1，隨后他們還詳細揭示了酶中關鍵氨基酸的催化調控作用。最終，他們提出了在SpnF酶反應中，與傳統的化學理論中的熱力學（thermodynamics）控制與動力學（kinetics）控制不同的觀點，認為這是一種全新的蛋白氨基酸“動態學效應”（dynamical effects）所控制的酶催化調控作用。