實驗概要
利用RACE(利用PCR技術快速擴增全長mRNA)技術構建全長cDNA文庫是傳統C庫構建技術的改進。本實驗即是利用寡核苷酸帽法，進行全長C庫的構建，從而掌握RACE技術的原理與基本操作方法。
實驗原理
其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子結構作為標簽，用通用引物識別并配對標簽序列，PCR擴增后克隆PCR產物，從而構建出全長并有正確閱讀框架的C庫。
RACE技術最早是cDNA水平上加接頭，以擴增未知5’序列。而隨著技術的進展，目前RACE技術已發展到直接以mRNA為模板進行操作，這就保證了全長cDNA的克隆，為研究5’和3’非編碼區及啟動子提供了條件。
RACE分3’RACE和5’RACE。3’RACE原理如圖1。其用帶olig(dt)和特異酶切位點的序列為3’引物；用特異序列為5’引物，經RT－PCR后，擴增出3’全長序列，利用特異酶切位點，插入載體。
5’RACE分兩種，其一為SMART（Mechanism At 5' end of the RNA Transcript）技術，其原理為在合成cDNA的反應中事先加入的3'末端帶Oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5'末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結構”，即甲基化的G時會連續在合成的cDNA末端加上幾個（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉錄酶會自動轉換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）或特異3’序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后擴增。由于有5'帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA其5’端為完整序列。其二為寡核苷酸帽法(Oligo capping method)。其原理如圖2。具體為利用CIAP脫磷，而全長mRNA由于有帽子結構，不被CIAP作用，這樣非mRNA及無帽子結構的5’不完整mRNA5’端為OH結構。然后用TAP（煙草酸性焦磷酸化酶，tobacco acid pyrophosphatase）焦磷酸化帽子結構，使5’完整的mRNA在5’端帶磷酸基團。用RNA連接酶將無磷酸化的adapt連接到5’末端，3’引物RT后，adapt配對序列擴增，這時由于只有5’完整mRNA才有接頭序列，因此擴增的結果只能是擴增出5’完整的mRNA。在此過程中PCR的放大作用，使低豐度的基因也能被信號放大。利用RACE技術構建全長cDNA文庫，是綜合利用3’和5’RACE，3’RACE引物選擇poly(A)，5’RACE引物選擇帽子結構，這樣使得擴增產物為帶有5’、3’非編碼區、起始密碼、中止密碼的完整cDNA。利用RACE技術建庫時，模板RNA可為總RNA或mRNA，但要擴增低豐度樣品，以純化的mRNA為模板為好。模板用量一般為總RNA1-5ug;mRNA為50-250ng。
主要試劑
RACE試劑盒（invitrogen），飽和酚、氯仿/異丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE緩沖液
主要設備
恒溫水浴，離心機、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀
實驗步驟
1. RNA、mRNA提取(略)
2. mRNA5’端加接頭
1) 脫磷酸化
A. 按次序加入下述試劑
RNA/mRNA Xul(RNA1-5ug，mRNA50-250ng)
10×CIP buffer 1ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
CIP(10u/ul) 1ul
加DEPC水到10ul
B. 混勻后50℃1hr， 輕微離心，置于冰浴。
C. 沉淀mRNA
a. 上述反應管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b. 1/10體積，3MpH5.2乙酸鈉、2體積乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀
c. 干燥后溶于7ulDEPC水中
2) 脫帽子結構
A. 依次加入下述試劑
脫磷酸化mRNA 7ul
10×TAP buffer 1ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
TAP(0.5U/ul) 1ul
B.混勻后37℃1hr， 輕微離心，置于冰浴。
C. 沉淀mRNA
a. 上述反應管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b. 1/10體積，3MpH5.2乙酸鈉、2體積乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀
c. 干燥后溶于7ulDEPC水中
3) 加接頭
A. 將上述7ul脫帽mRNA轉移至一含0.25ug5’RACE引物的管中，充分混勻并溶解引物后，離心。
B. 65℃，5min，以釋放可能有的二級結構，干燥至6ul，冰浴2min
C. 在上述6ul中依次加入
10×RNALigase buffer 1ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
ATP(10mM) 1ul
T4RNALigase(5U/ul) 1ul
D. 混勻后37℃1hr， 輕微離心，置于冰浴。
E. 沉淀mRNA
a. 上述反應管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b. 1/10體積，3MpH5.2乙酸鈉、2體積乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀
c. 干燥后溶于10ulDEPC水中
4) 合成第一鏈
A. 10ul上述mRNA樣品中加入1ul3’RACE引物，1uldNTP(10mM)，65℃，5min，以釋放可能有的二級結構。
B. 冰浴2min，以退火（如用隨機引物作3’引物，則在25℃放置10min。
C. 在上述6ul中依次加入
5×first buffer 4ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
DTT(100mM) 2ul
SuperScriptII(反轉酶)(200U/ul) 1ul
D.混勻后42℃50min。
E. 70℃15min 滅活RT酶，冰浴2min
F. 加入1ulRNA酶H（2U）37℃20min，水解Mrna（可不做）
5) PCR擴增
A. 反應液組成 5’與3’RACE引物各3ul，RT液2ul，其余同PCR實驗
B. 反應參數 如下表
溫度 | 時間 | 循環數 |
94℃ | 2min | 1 |
94℃ | 30sec | 5 |
72℃ | 1min/1kbDNA | |
94℃ | 30sec | 5 |
70℃ | 1min/1kbDNA | |
94℃ | 30sec | 20-25 |
60-68℃ | 30sec | |
68-72℃ | 1min/1kbDNA | |
68-72℃ | 10min | 1 |
6) PCR產物純化(略)
7) PCR產物克隆 PCR產物克隆至PCR－TOPO載體中，具體操作(略)。
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