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  • 發布時間:2019-08-02 10:58 原文鏈接: RAPD操作要點

    一、 材料
      不同來源的DNA(50ng/ul)。 
      二、設備 
      PCR儀,PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管,電泳裝置。 
      三、試劑 
      1、隨機引物(10mer) (5umol/L):購買成品。 
      2、Taq酶:購買成品。 
      3、10xPCR 緩沖液:配方見第八章。
      4、MgCl2 :25mmol/L。 
      5、dNTP:每種2.5mmol/L。 
      四、操作步驟: 
      1. 在25ul反應體系中,加入 
        模板DNA 1ul (50ng) 
        隨機引物 1ul (約5pmol) 
        10xPCR Buffer 2.5ul 
        MgCl2 2ul 
        dNTP 2ul 
        Taq酶 1單位(U) 
        加ddH2O 至 25ul 
      混勻稍離心, 加一滴礦物油。 
      2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然后循環: 94℃ 1分鐘, 36℃ 1分鐘, 72℃ 1分鐘,共40輪循環。 
      3. 循環結束后, 72℃ 10分鐘,4℃保存。
      4. 取PCR產物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩壓50-100V(電壓低帶型整齊, 分辨率高)。 
      5. 電泳結束,觀察、拍照。 
      [注意] 1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
          2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個新的分子標記應用。

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